Apakah kesan kepekatan suapan terhadap kaset ultrapenapisan?

Apabila saya mula bekerja dengan kaset ultrafiltrasi (UF) pada zaman awal saya sebagai pembekal penapis, saya akan mengakui bahawa saya tidak terlalu memikirkan kepekatan suapan selain daripada memeriksa sama ada penyelesaian yang saya pemprosesan adalah "cukup tebal". Itu berubah dengan pantas—apabila pelanggan bioteknologi memukul dinding dengan langkah kepekatan antibodi mereka, menyalahkan penyumbatan yang kerap dan kadar fluks yang tidak konsisten. Ternyata, mereka menolak lebih daripada yang boleh dikendalikan oleh kaset UF mereka, dan ia memerlukan masa henti selama berhari-hari dan sekumpulan produk mahal. Jika anda bekerja dengan kaset UF, ini bukan hanya butiran kecil—ia merupakan salah satu tuil terbesar yang membuat atau memecahkan proses anda, daripada hasil hingga masa berjalan. Mari kita pecahkan cara kepekatan suapan memberi kesan kepada setiap bahagian UF, dan perkara yang saya pelajari selama ini untuk memastikan perkara berjalan lancar.

Mula-mula, mari kita asaskan perkara ini dalam perkara yang sebenarnya dilakukan oleh kaset UF, hanya untuk memastikan kita berada di halaman yang sama. Jika anda baru dalam permainan ini, kaset UF ialah unit serba lengkap dengan membran rata (lihatKaset Lembaran Ratahalaman untuk pecahan penuh) yang memisahkan molekul mengikut saiz—barangan kecil melalui membran, manakala yang lebih besar "dikekalkan" dan tertumpu pada bahagian suapan. Apakah yang menjadikan mereka begitu popular dalam biopharma, makanan dan minuman, dan air sisa? Ia padat, boleh digunakan semula (kadangkala, jika dibersihkan dengan betul), dan jauh lebih konsisten daripada persediaan membran potong tangan yang lebih lama. TheUltrafiltrasi Kasettalian yang kami tawarkan dibina untuk larian berskala, daripada kumpulan kecil makmal kepada pembuatan penuh, itulah sebabnya kami telah bekerjasama dengan pelanggan daripada biotek permulaan kepada jenama makanan global.

Kepekatan suapan, bagi mereka yang belum mendalami istilah, pada asasnya adalah jumlah bahan larut sasaran (atau tidak diingini) dalam larutan yang anda pam ke dalam kaset. Contohnya, jika anda menumpukan antibodi monoklonal (mAbs) daripada sup kultur sel, kepekatan suapan di sini ialah berapa gram mAb bagi setiap liter sup tersebut. Ia bukan sekadar sasaran, sama ada—anda mempunyai kekotoran seperti serpihan sel, komponen media dan sisa garam penimbal yang bercampur juga. Tempat manis untuk kepekatan suapan adalah berbeza bergantung pada pemotongan berat molekul membran anda (MWCO), bukan? Kaset UF 30KD berfungsi hebat untuk protein kecil, manakala kaset 500KD adalah untuk molekul yang lebih besar seperti vektor virus. Saya telah melihat pelanggan mengambil kaset pertama yang mereka lihat, tanpa mengira kepekatan suapan mereka, dan di situlah kesilapan bermula.

Mari kita mulakan dengan kesan yang paling segera: kadar fluks. Fluks ialah isipadu larutan yang melalui membran per unit luas sejam—ia adalah tulang belakang produktiviti UF. Apabila kepekatan suapan anda terlalu tinggi, fluks turun dengan cepat, dan bukan secara linear. Inilah sebabnya: semasa anda memproses penyelesaian, zat terlarut terkumpul berhampiran permukaan membran, membentuk apa yang dipanggil "lapisan polarisasi kepekatan." Lapisan itu bertindak seperti penghalang tambahan, jadi air dan bahan larut kecil perlu bekerja lebih keras untuk melaluinya. Jika kepekatan suapan adalah lebih tinggi untuk dimulakan, lapisan polarisasi itu menjadi tebal dengan cepat, dan tidak lama lagi anda hampir tidak dapat menembusi sebarang peresapan. Saya mempunyai pelanggan tahun lepas menjalankan Kaset Ultrafiltrasi 30KD pada supernatan kultur sel padat—mereka makan pada 25 g/L protein, apabila cadangan kami ialah 10-15 g/L. Fluks mereka turun daripada 60 L/m²/jam kepada 12 L/m²/jam dalam masa 2 jam, dan mereka terpaksa ditutup untuk membersihkan kaset lebih awal, membazirkan masa tayangan selama 12 jam. Lebih teruk lagi, polarisasi kepekatan yang tinggi menyebabkan beberapa protein tersekat dalam lapisan itu, jadi hasil mereka adalah 18% lebih rendah daripada yang dijangkakan.

Tetapi ia bukan sahaja fluks—kepekatan suapan juga berkaitan secara langsung dengan kekotoran membran, yang merupakan boogeyman besar UF. Pengotoran ialah apabila bahan terlarut, serpihan atau agregat melekat secara kekal pada permukaan membran atau dinding liang, dan ia menjadi lebih teruk dengan suapan yang terlalu pekat. Apabila zat terlarut dihimpit bersama dalam suapan, ia lebih berkemungkinan berlanggar dengan membran dan terperangkap. Saya telah membersihkan beratus-ratus kaset UF selama bertahun-tahun, dan 80% daripada masa, kesan kekotoran berat kembali kepada kepekatan suapan yang 2–3x julat yang disyorkan. Sebagai contoh, pelanggan makanan yang memproses jus buah ingin menumpukan kepada 30° Brix dalam satu pas, bukannya 15° Brix (yang merupakan titik manis untuk kaset 10KD mereka). Pektin dan gula jus mula terkumpul pada membran dalam masa 30 minit, dan pada penghujung larian, pori-pori membran telah tersumbat sebahagiannya, jadi mereka hanya mendapat satu perempat daripada kepekatan yang mereka jangkakan, dan terpaksa menggantikan kaset selepas tiga larian dan bukannya 10. Ini menambah kos seliter yang lebih tinggi berbanding jika mereka membahagikan kepekatan kepada dua pas dengan kepekatan suapan yang lebih rendah setiap kali.

Hasil adalah satu lagi kawasan di mana kepekatan makanan mencecah teruk, terutamanya dalam biopharma di mana setiap gram produk penting. Apabila suapan anda terlalu pekat, bukan sahaja anda mendapat lebih banyak kekotoran, tetapi anda juga mula melihat kehilangan produk dalam dua cara. Pertama, lapisan polarisasi kepekatan boleh menangkap molekul sasaran, dan jika ia menjadi terlalu tebal, molekul tersebut mungkin terbawa-bawa bersama retentat apabila anda mengalirkan kaset, bukannya pekat. Kedua, beberapa molekul sasaran (seperti protein) boleh mula teragregat pada kepekatan tinggi, dan agregat tersebut selalunya cukup kecil untuk tergelincir melalui membran atau tersekat dalam peresapan, jadi anda kehilangannya. Pelanggan vektor virus yang saya bekerjasama tahun lalu menggunakan Kaset Ultrafiltrasi 500KD kami untuk menumpukan vektor AAV—mereka menolak kepekatan suapan kepada 1e13 genom vektor per mL, yang jauh melebihi pengesyoran kami 2e12. Hasil mereka hanya 45%, berbanding 82% yang mereka peroleh apabila mereka menurunkan kepekatan suapan ke julat yang betul. Apabila kami menguji retentate, kami mendapati bahawa 30% daripada vektor sasaran mereka tersekat dalam lapisan polarisasi kepekatan, dan 15% lagi telah diagregatkan dan hilang. Itulah jenis pukulan yang boleh menjadikan keseluruhan kumpulan tidak bernilai, terutamanya apabila anda berurusan dengan proses yang mematuhi GMP di mana anda tidak boleh membuat lebih banyak produk dengan sesuka hati.

Tunggu, tetapi sebelum anda berfikir "kepekatan suapan yang lebih rendah sentiasa lebih baik"—itu juga tidak benar. Jika suapan anda terlalu cair, anda membuang masa dan kapasiti kaset. UF adalah paling cekap apabila anda menumpukan penyelesaian ke tahap yang munasabah, tetapi jika anda bermula dengan suapan yang terlalu nipis, anda akan menggerakkan volum lebih banyak daripada yang anda perlukan, yang meningkatkan kos tenaga untuk mengepam dan mengambil masa yang lebih lama untuk mencapai kepekatan sasaran anda. Contohnya, pelanggan makmal yang menumpukan sampel protein kecil menggunakan kaset 10KD dengan kepekatan suapan 0.1 mg/mL—mereka cuba mencapai 10 mg/mL, jadi mereka sedang memproses 100 mL larutan untuk mendapatkan 10 mL retentate. Mereka mengambil masa 8 jam, berbanding 2 jam apabila mereka menumpukan suapan terlebih dahulu melalui sentrifugasi kepada 0.5 mg/mL, jadi mereka hanya memproses 20 mL. Itulah perbezaan besar dalam tenaga kerja dan masa, terutamanya jika anda menjalankan beberapa kelompok sehari. Kuncinya ialah mencapai julat tengah itu—apa yang saya panggil "tetingkap kepekatan" untuk kaset dan aplikasi khusus anda.

Jadi bagaimana anda mengetahui tingkap konsentrasi itu? Ia bukan satu saiz untuk semua, tetapi terdapat beberapa peraturan praktikal yang kami kongsikan dengan semua pelanggan kami. Mula-mula, semak MWCO kaset anda: kaset dengan MWCO yang lebih tinggi (seperti 500KD) biasanya boleh mengendalikan kepekatan suapan yang lebih tinggi daripada MWCO yang lebih rendah (seperti 30KD), kerana liang-liangnya lebih besar, jadi polarisasi tidak menjadi masalah. kamiSiri penapisan Kaset-TFFhalaman mempunyai julat kepekatan khusus untuk setiap kaset, tetapi sebagai peraturan umum, jangan sekali-kali melebihi 10-15% jumlah pepejal untuk kebanyakan aplikasi protein, dan 5-10% untuk molekul kecil. Kedua, uji suapan anda untuk kekotoran: jika suapan anda mempunyai banyak serpihan atau agregat, anda memerlukan kepekatan suapan yang lebih rendah untuk mengelakkan kekotoran, tidak kira apa molekul sasaran anda. Ketiga, jalankan ujian berskala kecil dahulu—jangan hanya melompat ke dalam pengeluaran penuh. Larian ujian 100 mL atau 1 L akan memberitahu anda dengan tepat apa fluks yang anda perolehi, berapa cepat fouling berlaku, dan hasil yang boleh anda jangkakan, supaya anda tidak membazirkan produk yang berharga.

Perkara lain yang saya perhatikan selama ini ialah kepekatan suapan berinteraksi dengan parameter proses lain, seperti kadar aliran silang dan tekanan transmembran (TMP). Ia bukan seperti melaraskan kepekatan dalam vakum—jika anda mempunyai kepekatan suapan yang tinggi, anda boleh mengimbangi sedikit dengan meningkatkan kadar aliran silang, yang menyapu lapisan polarisasi dari permukaan membran dan meningkatkan TMP (tetapi tidak terlalu banyak, kerana TMP boleh menyebabkan pemadatan lapisan polarisasi). Tetapi ini adalah tindakan mengimbangi: aliran silang yang lebih tinggi bermakna lebih banyak tenaga, dan TMP yang lebih tinggi boleh menyebabkan kerosakan membran jika anda tidak berhati-hati. Kami sentiasa menasihati pelanggan untuk menjalankan ujian parameter penuh yang termasuk kepekatan suapan, kerana menukar satu boleh membuang yang lain. Sebagai contoh, pelanggan pernah cuba membetulkan kejatuhan fluks daripada kepekatan suapan yang tinggi dengan menaikkan TMP, dan akhirnya memampatkan membran, jadi larian seterusnya mempunyai fluks yang lebih rendah. Itulah sebabnya di syarikat kami, kami bukan sekadar menjual kaset—kami membantu pelanggan kami mengatasi masalah proses ini, kerana kami telah melihat hampir setiap kesilapan yang boleh anda lakukan dengan penumpuan suapan.

Mari kita bincangkan tentang kesan jangka panjang juga, kerana kepekatan suapan bukan sahaja memberi kesan kepada satu larian—ia memberi kesan kepada jangka hayat kaset. Jika anda menjalankan suapan yang terlalu pekat, anda akan menghasilkan lebih banyak kekotoran, yang bermaksud anda perlu membersihkan kaset dengan lebih kerap dan agen pembersih yang lebih agresif (seperti pH atau suhu yang lebih tinggi) untuk menyingkirkan pengumpulan. Dari masa ke masa, pembersihan agresif itu merendahkan membran, jadi kaset mempunyai lebih sedikit larian di dalamnya sebelum ia perlu diganti. Saya mempunyai pelanggan yang menjalankan Kaset Helaian Rata kami, dan pada larian ke-5, mereka terpaksa menggantikannya kerana pelanggaran berat, manakala pelanggan lain menjalankan kaset yang sama pada kepekatan suapan yang betul mendapat 15+ larian. Itulah perbezaan kos yang besar apabila anda menggunakan kaset setiap minggu berbanding setiap bulan.

Sekarang, mari kita berlatih—apa sebenarnya yang perlu anda lakukan jika kepekatan suapan anda tidak aktif? Pertama, ukur dengan betul. Ramai pelanggan menggunakan "ketebalan visual" penyelesaian, yang sangat tidak tepat. Gunakan meter Brix untuk produk makanan, atau penyerapan (seperti A280 untuk protein) untuk mendapatkan kepekatan yang tepat. Kemudian, laraskan suapan anda sama ada dengan mencairkannya (jika terlalu tinggi) atau menumpukan lebih lanjut dengan langkah pra-pemprosesan yang lebih kecil (seperti penapisan aliran tangen dengan kaset yang berbeza, atau sentrifugasi) jika terlalu rendah. Jika anda berurusan dengan suapan yang unik, seperti biologi tersuai, hubungi pasukan kami—kami mempunyai pakar aplikasi yang boleh membantu anda mereka bentuk proses yang disesuaikan dengan kepekatan suapan anda, sama ada itu memilih MWCO yang betul (seperti 30KD lwn. 500KD), melaraskan aliran silang atau memikirkan masa larian yang terbaik.

Saya tidak boleh cukup menekankan betapa banyak tweak kecil untuk kepekatan suapan boleh mengubah keseluruhan proses UF anda. Ia bukan perincian yang membosankan—Ia adalah perbezaan antara larian yang mencapai semua hasil dan matlamat garis masa anda serta larian yang menyebabkan anda menyelesaikan masalah selama beberapa hari, membazirkan produk dan wang. Kami telah membina kamiUltrafiltrasi Kasettalian menjadi fleksibel, dengan pilihan untuk MWCO yang berbeza (seperti kamiKaset Ultrafiltrasi 30kddanKaset Ultrafiltrasi 500KD), reka bentuk helaian rata dan persediaan siri TFF, kerana kami tahu bahawa setiap suapan pelanggan adalah berbeza. Jika anda bergelut dengan isu kepekatan suapan, atau hanya mahu menjadikan proses UF anda lebih cekap, kami bersedia membantu—kami telah bekerjasama dengan beribu-ribu pelanggan untuk memastikan tingkap tumpuan mereka betul, dan kami boleh melakukan perkara yang sama untuk anda. Jangan biarkan butiran kecil seperti penumpuan suapan merosakkan larian anda—hubungi pasukan kami untuk mengetahui lebih lanjut tentang mengoptimumkan proses anda hari ini.

Rujukan

1. Belfort, G., Davis, RH, & Zydney, AL (1994). Kelakuan ampaian dan penyelesaian makromolekul dalam penapisan mikro aliran silang. Jurnal Sains Membran, 96(1–2), 1–58.
2. Charcosset, C. (2007). Hidrodinamik dan polarisasi kepekatan dalam ultrafiltrasi: Kajian semula. Penyahgaraman, 211(1–3), 108–122.
3. Zydney, AL (2018). Penapisan aliran tangensial untuk pemprosesan biofarmaseutikal. Pendapat Semasa dalam Kejuruteraan Kimia, 20, 109–115.
4. Mulder, M. (1996). Prinsip Asas Teknologi Membran (edisi ke-2). Penerbit Akademik Kluwer.