Perbincangan Ringkas Beberapa Kaedah Unik Serat Berongga dalam Pemurnian Bod Kemasukan

Badan Kemasukan (IB) ialah zarah protein berketumpatan tinggi, tidak larut yang dibalut dengan membran yang terbentuk apabila gen asing diekspresikan dalam sel prokariotik, terutamanya dalam Escherichia coli. Apabila diperhatikan di bawah mikroskop, IB adalah kawasan pembiasan tinggi, yang jelas berbeza daripada komponen lain dalam sitoplasma.

Pembentukan badan kemasukan agak kompleks, berkaitan dengan kadar pengeluaran protein dalam sitoplasma, kepekatan peptida yang baru dihasilkan adalah tinggi, dan tidak ada masa yang cukup untuk melipat, sehingga membentuk agregat protein amorf. Badan rangkuman pada asasnya terdiri daripada protein, lebih daripada 50% daripadanya adalah produk klon. Struktur utama produk ini betul-betul betul, tetapi konfigurasi tiga dimensi adalah salah, jadi tiada aktiviti biologi. Saiz badan kemasukan ialah 0.5-1μm, tidak larut dalam air, hanya larut dalam denaturan seperti urea, guanidine hidroklorida, dsb.

Dalam E. coli, badan kemasukan boleh berlaku di dua lokasi sel: sitoplasma dan sitoplasma periferi. Lokasi dan ciri badan kemasukan dalam sel bergantung pada cara protein dinyatakan.

Kemasukan dalam sitoplasma E. coli biasanya berkisar diameter dari {{0}}.2 hingga 1.5μm, dan protein yang berbeza mempunyai diameter yang berbeza, seperti saiz interferon ialah 0.811μm, dan saiz prorennet ialah 1.281μm. Dalam sesetengah kes, diameter sesetengah badan inklusi lebih besar daripada diameter E. coli, yang memberikan E. coli penonjolan. Secara umum, sel hanya mempunyai satu badan kemasukan.

 

Pemurnian badan inklusi

 

Proses pembersihan badan inklusi secara amnya adalah:

Penghancuran sel:

Teknologi umum penghancuran sel ialah: penghancuran tisu berkelajuan tinggi, homogenisasi penghomogen kaca, rawatan ultrasonik, kaedah pencairan beku berulang, rawatan kimia (biasanya menggunakan rawatan lisozim).

 

Pencucian badan inklusi:

Badan rangkuman ialah zarah pepejal tidak aktif yang dibentuk oleh aglutinasi intraselular protein yang dinyatakan oleh bakteria, yang biasanya wujud dalam bentuk amorf dan tidak larut. Dalam badan kemasukan, protein sasaran sebenar hanya menyumbang kira-kira 50%, dan selebihnya mengandungi lipid, lipopolisakarida, asid nukleik dan heteroprotein, yang terikat pada badan kemasukan dan menjejaskan semula protein badan kemasukan. Oleh itu, mencuci sebelum denaturasi adalah langkah yang sangat perlu.

Di samping itu, pencucian badan inklusi membantu meningkatkan hasil lipatan semula protein rekombinan. Dengan membuang kekotoran, halangan dalam proses renaturasi dapat dikurangkan, supaya protein dapat dilipat dengan lebih cekap dan dipasang dengan betul, dengan itu meningkatkan aktiviti dan fungsi protein‌.

Basuh yang biasa digunakan kurang daripada 1% daripada detergen neutral, seperti Tween, Triton, Urea dan NP40 plus EDTA dan agen pengurangan 2-mercaptotreitol (DTT), -mercaptoethanol diulang berkali-kali, kerana kapasiti pencucian detergen dipertingkatkan dengan peningkatan kekuatan ionik larutan, dalam mencuci badan kemasukan boleh ditambah NaCl untuk meningkatkan kekuatan ionik.

Badan rangkuman boleh digunakan untuk mengalih keluar komponen lain larutan pecahan sel melalui sentrifugasi atau penapisan, yang kedua-duanya memanfaatkan sifat fizikal badan rangkuman yang berbeza.

 

Emparan:

Protein badan rangkuman adalah jauh lebih tumpat daripada isipadu serpihan sel yang sama, jadi badan rangkuman boleh diasingkan daripada seluruh sel melalui sentrifugasi. Sentrifugasi berterusan adalah operasi yang paling kerap digunakan untuk mendapatkan badan kemasukan dalam pengeluaran perindustrian. Oleh kerana ketumpatan serpihan sel adalah lebih kecil daripada badan kemasukan, kadar pemendapan adalah lebih kecil daripada badan kemasukan. Suspensi dan sentrifugasi berterusan boleh mengempar sebahagian besar badan kemasukan, manakala serpihan sel dikeluarkan secara beransur-ansur.
Penapisan (penapisan aliran tangensial): Disebabkan oleh saiz molekul badan rangkuman dan protein larut yang berbeza, kaedah penapisan boleh digunakan, yang boleh mengurangkan kos operasi dan menjadikannya mudah untuk ditingkatkan. Penapisan aliran tangensial (TFF) didorong oleh perbezaan tekanan transmembran. Bahan dan kekotoran yang lebih kecil daripada saiz liang membran melalui membran, manakala kekotoran seperti sel dengan zarah yang lebih besar terperangkap. Apertur membran yang biasanya digunakan untuk pencucian penapisan ialah 0.1μm. Mikrofiltrasi aliran tangen gentian berongga boleh secara langsung berurusan dengan kandungan pepejal yang tinggi bahan cecair, langkah yang lebih sedikit, operasi mudah, membran boleh digunakan berulang kali melalui pembersihan, mengurangkan pelaburan peralatan dan kos operasi, selaras dengan keperluan pengeluaran automatik modular.

 

Berikut ialah kes aplikasi untuk mencuci badan inklusi menggunakan tiang gentian berongga Guidling.

Kami menggunakan 94cm2 0.1-0.45μm gentian berongga untuk memekatkan 250mL cecair (berat molekul protein sasaran 17kd). Dalam keseluruhan proses pencucian, kadar pemulihan protein sasaran dan penyusutan fluks membran telah disiasat.

0-71min ialah proses kepekatan, 71-224min ialah proses pencucian dan penapisan. Semasa keseluruhan proses penapisan mikro, TMP meningkat secara beransur-ansur, kelajuan masuk cecair kekal tidak berubah, dan fluks bahan purata ialah 12LMH.

Keputusan menunjukkan bahawa protein sasaran telah terperangkap sepenuhnya, dan kadar pemulihan protein sasaran adalah lebih daripada 90%. Lajur gentian berongga guidling adalah stabil dan sesuai untuk aplikasi ini.

 

Pembubaran badan kemasukan:

Badan rangkuman biasanya dibubarkan di bawah keadaan agen denaturasi urea atau guanidine hidroklorida, dan protein badan rangkuman terlarut didenaturasi sepenuhnya, iaitu, kecuali struktur primer dan ikatan kovalen dikekalkan, semua ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik dimusnahkan, dan hidrofobik. rantai sisi terdedah sepenuhnya.

Urea dan guanidine hidroklorida adalah denaturan kekuatan sederhana, yang mudah dikeluarkan melalui dialisis dan ultraturasan. Kepekatan am urea 8-10M, guanidine hydrochloride 6-8M. Pembubaran urea mempunyai kelebihan bukan pengionan, neutral, kos rendah, penyingkiran protein selepas renaturasi tidak akan menyebabkan sejumlah besar pemendakan protein, dan badan kemasukan terlarut boleh disucikan dengan pelbagai kaedah kromatografi, jadi ia telah digunakan secara meluas. .

 

Pelipatan semula protein badan kemasukan:

Protein rekombinan terlarut mesti dilipat dengan betul untuk membentuk protein berfungsi. Teknik untuk renaturasi termasuk pencairan larutan protein kepada hampir neutral, penyingkiran denaturan, renaturasi pada lajur, dan kromatografi penapisan gel. Antaranya, mencairkan larutan protein kepada hampir neutral dan mengeluarkan denaturan adalah kaedah klasik renaturasi yang biasa, terutamanya kaedah renaturasi pencairan mempunyai kadar penggunaan tertinggi.

Penyingkiran denaturan:

Dialisis: Kelebihannya ialah volum tidak meningkat, dan kadar penyingkiran denaturan dikawal dengan mengurangkan secara beransur-ansur kepekatan cecair telap luaran, tetapi ia mengambil masa yang lama dan mudah untuk membentuk agregat protein tidak aktif, yang tidak sesuai untuk operasi berskala besar dan tidak boleh digunakan pada skala pengeluaran.

Ultrafiltration (TFF): mudah untuk mengawal kelajuan dialisis, sama ada dalam penyelidikan dan pembangunan, ujian perintis atau pengeluaran, boleh menghilangkan denaturan (perubahan cecair + kepekatan) melalui ultrafiltrasi (TFF).

 

Pemurnian protein badan kemasukan:

Kaedah penulenan protein selepas renaturasi adalah serupa dengan penulenan protein larut, iaitu kromatografi pertukaran ion, kromatografi penapisan gel, kromatografi afiniti, pemendakan garam ammonium sulfat, dsb.

Badan inklusi tidak mempunyai aktiviti biologi, tidak perlu risau tentang kehilangan aktiviti protein, dan sejumlah besar ekspresi tidak akan membawa kepada kematian sel, dan memaksimumkan ketahanan terhadap serangan protease. Gentian berongga Jiuling boleh digunakan secara fleksibel dalam proses penulenan hiliran badan kemasukan. Dalam langkah mencuci badan kemasukan, prestasi yang sangat baik, berbanding dengan mencuci emparan, penggunaan gentian berongga penapisan mikro teknologi umur sembilan untuk mencuci penapisan aliran tangen boleh memendekkan masa proses, dan kadar pemulihan umum boleh mencapai lebih daripada 90%. Serat berongga Jiuling juga boleh digunakan dalam langkah renaturasi protein badan kemasukan. Kekeruhan cecair suapan yang ditapis oleh gentian berongga penapisan mikro akan dikurangkan dengan ketara, dan kadar pemulihan protein adalah tinggi; Penggunaan gentian berongga ultrafiltrasi bukan sahaja dapat mengeluarkan denaturan, tetapi juga memendekkan masa memuatkan sampel kromatografi, supaya dapat menjimatkan masa, mengurangkan jumlah pengisi dan mengurangkan kos pengeluaran. Kadar pemulihan gentian berongga penapisan mikro/ultrafiltrasi berbeza dengan bahan yang berbeza, dan kadar pemulihan umum boleh mencapai 90-95%.

Teknologi Guidling mengalu-alukan anda untuk meminta kit ujian untuk ulasan berkaitan.

 

Mengenai Guidling

Guidling Technology ialah perusahaan teknologi tinggi negara yang memfokuskan pada biofarmaseutikal, kultur sel, penulenan dan kepekatan bioperubatan, diagnosis dan cecair industri. Kami telah berjaya membangunkan peranti penapis emparan, kaset ultraturasan & penapisan mikro, penapis virus, sistem TFF, penapis kedalaman, gentian berongga, dll. Yang memenuhi sepenuhnya senario aplikasi biofarmaseutikal, kultur sel, dan sebagainya. Membran dan penapis membran kami digunakan secara meluas dalam kepekatan, pengekstrakan dan pengasingan pra-penapisan, penapisan mikro, ultraturasan dan penapisan nano. Barisan produk kami yang banyak, daripada penapisan makmal sekali guna kecil kepada sistem penapisan pengeluaran, ujian kemandulan, penapaian, kultur sel dan banyak lagi, memenuhi keperluan ujian dan pengeluaran. Teknologi Guidling tidak sabar-sabar untuk bekerjasama dengan anda!