Ringkasan:

Artikel ini mengkaji dua faktor utama yang mesti dipertimbangkan dalam strategi pemurnian protein: keperluan aplikasi hiliran dan ciri -ciri biologi protein itu sendiri. Artikel ini menekankan bahawa pembersihan protein berkualiti tinggi adalah asas untuk kebolehpercayaan dan kebolehulangan data eksperimen, terutamanya untuk pengeluaran protein rekombinan. Senario aplikasi yang berbeza mempunyai keperluan khusus untuk kesucian protein, aktiviti atau kandungan endotoxin, dan ciri -ciri protein boleh menjejaskan strategi pemurnian dengan ketara. Menurut kes -kes tertentu, artikel itu menggambarkan bahawa protein yang unik harus mengguna pakai skim pemurnian yang disesuaikan. Akhirnya, proses pengeluaran protein yang sistematik dicadangkan (Rajah 1), menekankan kawalan kualiti proses penuh dari pemilihan sistem ekspresi, reka bentuk pembinaan untuk pengoptimuman pembersihan, dan mengesyorkan penilaian homogenitas dan fungsi protein melalui teknik biofisik (seperti sec-MALS, DSF, dan lain-lain). Artikel ini bertujuan untuk menyediakan panduan praktikal untuk penyelidik, membantu mereka merumuskan strategi pembersihan yang cekap dan berulang berdasarkan ciri -ciri dan keperluan aplikasi protein sasaran, dengan itu meningkatkan kualiti dan kecekapan penyelidikan saintifik.

 

Rajah 1. Skema gambarajah proses pengeluaran protein

 

Pengeluaran Protein Tinggi Tinggi - Contoh Pengenalpastian Masalah, Reka Bentuk Strategi Mitigasi dan Output yang Sejajar

 

1. Nucleic Acid mengikat kepada protein:

Apabila memurnikan protein mengikat asid nukleik, pelbagai langkah diperlukan untuk menghilangkan pencemaran asid nukleik. Semasa lisis, nukleus (seperti SM nukleus (Benzonase®) atau DNase atau RNase) perlu ditambah, tetapi asid nukleik terikat tidak dapat dikeluarkan sepenuhnya. Gantikan langkah-langkah penyingkiran asid nukleik, seperti pemendakan PEI atau streptomycin sulfat, penyucian heparin atau kromatografi pertukaran ion. Kehadiran asid nukleik dipantau oleh nisbah A26 0 nm/a28 0 nm sepanjang proses pembersihan. Sekiranya nisbahnya lebih rendah daripada 0.6, ia menunjukkan bahawa kesucian protein agak tinggi dan pencemaran asid nukleik adalah minimum. Bagi protein yang mempunyai asid nukleik yang terikat, mereka boleh diturunkan sementara (seperti dirawat dengan urea) dan kemudian renaturated. Mata Utama: Gunakan reagen berkualiti tinggi, penampan segar dan lajur bersih (Bersih dengan 0.5m NaOH sebelum digunakan).

 

2. Rantaian berat ferritin tetikus:

Tujuan untuk menghasilkan protein rantaian berat ferritin tikus (MFTH1) yang disucikan adalah mikroskopi cryo-elektron tunggal-zarah resolusi tinggi (Cryo-EM). Vektor ekspresi Escherichia coli yang dikodkan MFTH1 yang tidak dilabelkan secara ultrasonik terganggu tanpa menambahkan sebarang nukleus. Selepas pemanasan pada tahap 7 0, ia menjalani pemendakan ammonium sulfat, dialisis dan langkah -langkah kromatografi pengecualian saiz. Sampel yang dihasilkan menunjukkan kehadiran sejumlah besar bahan cemar dalam imej mikroskopi cryo-elektron (Rajah 2A), yang tidak sesuai untuk permohonannya. Mengoptimumkan langkah -langkah. Tambah nuclease SM semasa proses lisis sel dan proses dialisis selepas hujan sulfat ammonium, dan kemudian tambah langkah kromatografi pertukaran anion untuk mengurangkan nisbah A26 0 nm/a280nm dari 1.4 hingga 0.8. Selepas kromatografi pengecualian saiz, nisbah A260nm/A280Nm sampel MFTH1 terakhir ialah 0.56. Imej mikroskopi SDS-PAGE dan cryo-elektron (Rajah 2B) menunjukkan bahawa protein sangat murni, menunjukkan bahawa bahan cemar telah dikeluarkan dengan berkesan.

Rajah 2 rantaian berat ferritin tetikus

 

 

 

3. Protein Chimeric DSRBEC Manusia (DSRBD-EGF- Chimera):

DSRBEC dibentuk oleh gabungan domain mengikat RNA dua kali ganda (DSRBD) kinase protein manusia dan faktor pertumbuhan epidermis manusia (HEGF). Apabila DSRBD dinyatakan dalam Escherichia coli, ia menunjukkan keupayaan mengikat dsRNA yang sangat tinggi. Selepas lisis sel, RNA yang mencolok akan menghalang pengikatan protein rekombinan ke lajur kromatografi afiniti logam tetap (IMAC). Kaedah konvensional seperti pemendakan PEI atau streptomycin sulfat, rawatan RNase atau penyelesaian penimbal garam tinggi tidak dapat mengeluarkan RNA. Lysis sel dilakukan menggunakan penampan yang mengandungi urea 4m. Supernatan dimuatkan ke lajur iMac, dan 4m hingga {4}} m urea perlahan -lahan digunakan semalaman (renaturasi lajur). Penampan renaturasi telah ditambah dengan imidazole dan dielakkan dari lajur IMAC. Penambahbaikan terakhir dilakukan melalui penapisan gel Superdex 75 untuk mendapatkan DSRBEC aktif secara fungsional.

 

4. Protein terikat kepada kation divalen atau cofactors lain:

Untuk protein yang berinteraksi dengan kation divalen seperti Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+, atau cofactors lain, adalah penting untuk menambah kation divalen tertentu (atau cofactors lain) semasa ekspresi. Sebilangan kecil kation divalen yang sama (atau cofactors lain) juga diperlukan semasa proses pembersihan. Walau bagaimanapun, penggunaan mana -mana ejen chelating (seperti EDTA, EGTA) dan agen pengurangan chelating (seperti DTT atau DTE) mesti dielakkan. Apabila berurusan dengan protein yang terikat pada kation divalen, campuran inhibitor protease tanpa agen chelating mesti digunakan untuk mengesahkan kehadiran sebenar kation divalen (atau cofactors lain) dalam protein yang disucikan melalui kaedah spektroskopi (seperti spektrofotometri penyerapan atom).

 

5. Ferridoxin rekombinan (RFD) yang mengandungi satu kelompok [2Fe ± 2s] dari cyanobacteria thermophilic mastigocladus laminosus

Ferridoxin adalah protein besi-sulfur larut yang mengambil bahagian dalam tindak balas pemindahan elektron. Ferroredoxin jenis tumbuhan membawa satu kelompok [2Fe ± 2S] sebagai penerima elektron fotosistem I. Strain Escherichia coli BL21 (DE3) menyatakan protein RFD rekombinan dalam medium TB yang mengandungi 10mm FECL3 dan antibiotik. Elusi lajur penangkapan IMAC dilakukan menggunakan penampan yang mengandungi 10mm histidine untuk mengelakkan imidazole dan mencegah kemusnahan kelompok [2Fe ± 2S]. Anion Exchange dan Chromatografi Pengecualian Saiz digunakan untuk pembersihan dan kepekatan selanjutnya kepada 12mg/ml untuk pemeriksaan penghabluran. Berbanding dengan pengeluaran rekombinan ferroredoxin, ferroredoxin semulajadi yang disucikan dari alga biru-hijau mastigocladus laminosus mencapai resolusi yang lebih tinggi semasa penghabluran.

 

6. Protein digunakan sebagai antigen

Protein sering digunakan sebagai antigen untuk memulihkan ligan khusus sasaran. Perkara pertama yang perlu dipertimbangkan ialah sama ada protein digunakan untuk imuniti vivo untuk mendapatkan IgG monoklonal atau poliklonal konvensional, atau untuk program yang melibatkan CAMEL IgG atau proses pemilihan in vitro.

 

6.1 Antigen yang digunakan untuk pengeluaran antibodi rutin

Apabila antigen digunakan untuk menghasilkan antibodi IgG monoklonal, lipatan antigen yang betul biasanya tidak diperlukan, kerana kebanyakan antibodi monoklonal mengiktiraf epitope linear yang tidak banyak dipengaruhi oleh struktur antigen, dan juga antigen denatured (seperti protein badan inklusi) tetap berkesan. Walau bagaimanapun, kesucian mesti dikawal dengan ketat untuk mengelakkan pencemaran imunogenik yang kuat mengganggu tindak balas imun dan menyebabkan dominasi antibodi bukan sasaran.

 

6.2 Pemeriksaan Perpustakaan Konjugasi

Perhatian khusus perlu dibayar untuk mengekalkan penyesuaian semula jadi antigen semasa pemprosesan perpustakaan nanobody yang diperolehi oleh imunisasi unta. Tidak seperti antibodi konvensional, antibodi unta (terutamanya nanobodies) cenderung mengiktiraf epitope struktur, yang berkaitan dengan struktur tapak pelengkap unik mereka. Begitu juga, apabila menyaring perpustakaan antibodi sintetik atau semulajadi yang besar secara in vitro, antigen mesti mengekalkan struktur yang sepenuhnya konsisten dengan aplikasi sasaran. Oleh kerana proses pemeriksaan itu sendiri tidak berat sebelah, jika antigen mempunyai kesilapan, pengagregatan atau heterogeniti konformasi, sejumlah besar konjugasi yang mensasarkan epitope bukan semulajadi boleh ditayangkan.

 

 

 

7. Protein yang mengandungi ikatan disulfida intermolecular atau intramolekul atau sistein percuma

Bon disulfida adalah penting untuk menstabilkan struktur semulajadi protein. Semasa proses pembersihan, apabila protein pembersihan yang mengandungi ikatan disulfida intermolecular atau intramolekul, adalah perlu untuk mengelakkan menambah ejen pengurangan untuk mencegah perubahan konformasi protein, dengan itu mengubah fungsi mereka. Bagi protein yang mengandungi cysteine ​​percuma, pengurangan ejen sangat diperlukan dalam semua langkah proses pembersihan, terutamanya semasa penyimpanan, untuk mengelakkan pembentukan bon disulfida buatan. Ejen pengurangan yang paling biasa digunakan ialah dithiothreitol (DTT), -mercaptoethanol (-me), dan tris (2- carboxyethyl) fosfin hydrochloride (TCEP). Untuk resin iMac yang tidak serasi dengan DTT atau TCEP, disyorkan untuk menggunakan -me dan menggantikannya dengan agen pengurangan lain dalam langkah -langkah berikutnya.

 

8. serpihan antibodi rekombinan

Walaupun struktur serpihan antibodi rekombinan (seperti nanobodies) lebih mudah daripada IgG, fungsi mereka bergantung kepada pembentukan ikatan disulfida yang betul. Dalam sistem ekspresi bakteria, walaupun dengan penggunaan strategi pengoptimuman, produk yang dilipat atau sebahagiannya dilipat mungkin masih berlaku, yang ada di bahagian larut dan dalam badan inklusi. Lebih tersembunyi adalah bahawa walaupun serpihan antibodi yang dilipat dengan betul boleh membentuk agregat larut (agregasi koloid) melalui plak hidrofobik di permukaan. Agregat sedemikian sukar untuk dikenal pasti dalam ujian fungsi rutin (seperti ELISA) kerana pengikatan multivalen boleh menutup penurunan dalam pertalian monomer, tetapi kehadiran mereka secara serius boleh mempengaruhi aplikasi yang bergantung pada saiz molekul kecil (seperti mikroskopi super resolusi). Oleh itu, bergantung semata-mata pada SDS-PAGE tidak mencukupi untuk menilai kualiti sampel. Kaedah biofisik seperti penapisan gel (Rajah 3) mesti digunakan untuk membezakan monomer (puncak utama) daripada agregat (puncak volum pengecualian). Titik kawalan utama termasuk: mengoptimumkan persekitaran redoks semasa ekspresi untuk menggalakkan pembentukan ikatan disulfida, dan mengoptimumkan keadaan penyimpanan selepas pembersihan untuk mencegah pengagregatan. Langkah -langkah ini adalah penting untuk memastikan monodispersiti dan fungsi serpihan antibodi.

Rajah 3. Pemisahan penapisan gel agregat larut nanobodies

 

9. Serpihan larut reseptor limfosit LLT1

Ekspresi rekombinan protein yang bergantung kepada ikatan disulfida (seperti reseptor limfosit LLT1) sering menghadapi kesukaran lipat. Penapisan gel LLT1 jenis liar menunjukkan puncak agregasi dan puncak dimer (Rajah 4A), tetapi spektrometri massa mendedahkan kesilapan yang disebabkan oleh sistein yang tidak berpasangan dalam dimer (Rajah 4B). Untuk tujuan ini, dua mutan telah direka: satu mengeluarkan masalah sistein, mengakibatkan penurunan secara tiba -tiba hasil (Rajah 4A); Selepas pengenalan Neocysteine ​​untuk membina semula ikatan disulfida yang disatukan, mutan bukan sahaja mempunyai hasil yang tinggi dan kestabilan yang baik, tetapi juga dapat mengkristalisasi (Rajah 4C), dan struktur 3D mengesahkan bahawa mutan membentuk ikatan disulfida yang betul dan mengekalkan lipatan semulajadi. Kes ini menunjukkan bahawa secara rasional merancang ikatan disulfida conformal, digabungkan dengan penapisan gel dan analisis spektrometri massa, masalah lipatan protein rekombinan dapat diselesaikan dengan berkesan, dan protein berfungsi dengan struktur yang stabil dan hasil yang tinggi dapat diperolehi.

Rajah 4. Pembinaan semula ikatan disulfida meningkatkan lipatan dan hasil larut LLT1

 

 

 

10. Protein yang mudah diagregatkan

Penyucian protein rekombinan sering menghadapi masalah pengagregatan, dan pembentukannya mengikuti mekanisme "nukleasi pertumbuhan"-sejumlah kecil agregat larut terbentuk terlebih dahulu dan kemudian mencetuskan agregasi tidak larut berskala besar. Untuk menangani cabaran ini, strategi pelbagai peringkat perlu diadopsi: Pada peringkat ekspresi, ini dapat dicapai dengan mengoptimumkan ketegangan, mengurangkan suhu budaya, menggunakan media kultur yang diubahsuai atau solubilisasi protein gabungan yang berbeza, dan menggantikan sistem-sistem yang lebih baik, dan lain-lain. daripada iMac ke SEC) hendaklah digunakan untuk segera mengeluarkan nukleus agregat. Secara umumnya, apabila penyelesaian penampan penyaringan, faktor -faktor seperti komposisi komponen, nilai pH, ejen pemisahan atau solubilizer perlu dipertimbangkan (Rajah 5). Melalui pengoptimuman pengesanan ortogonal yang baik (seperti Sec, Cd, LS, DSF dan peralihan suhu berdasarkan haba pendarfluor, dan lain -lain), kualiti protein dan penyelesaian penampan yang paling sesuai ditentukan.

Rajah 5. Strategi untuk mengurangkan pengagregatan protein

 

11. Penghabluran kinase clk1 manusia (bagaimana untuk mendapatkan kelompok yang boleh dihasilkan)

Untuk mendapatkan kinase CLK1 yang tidak fosforilasi untuk kajian penghabluran, skim kolaboratif multi-strategi telah diterima pakai. Pertama, ia telah dinyatakan bersama dengan λ -phosphatase di Escherichia coli untuk menghapuskan heterogenitas autofosforilasi. Walaupun hasilnya dikurangkan, dephosphorylation lengkap telah dipastikan. Selepas ditangkap oleh IMAC, eluen ditambah dengan penstabil (50mm arginine, 50mm asid glutamat dan 10mm DTT) untuk mencegah pengagregatan, tertumpu, dan tagnya dikeluarkan oleh pencernaan TEV. Kemudian, oligomer yang betul dipisahkan oleh SEC (mengandungi 5% gliserol dan -me). Langkah pertukaran anion penting akhir membezakan antara kumpulan CLK1 (bukan fosforilasi) dan bukan kristal (sebahagiannya fosforilasi). Ia amat perlu diperhatikan bahawa mod lisis sel memberi kesan yang ketara kepada kestabilan protein-kaedah tekanan tinggi dan suhu tinggi membawa kepada pengagregatan CLK1 yang tidak dapat dipulihkan, yang menonjolkan kepentingan rawatan ringan untuk penyediaan kinase.

 

 

 

12. Menghasilkan galectin -1 dengan keupayaan mengikat ligan yang stabil

Untuk menyediakan galectin berfungsi -1 untuk kajian mengikat ligand, strategi ekspresi dan pemurnian empat konstruk (tidak berlabel dan berlabel liar-jenis galectin -1, tidak berlabel dan berlabel mutan mutan. Penemuan utama menunjukkan bahawa penyucian kromatografi afiniti laktosa dapat menyaring protein yang dilipat dengan betul, tetapi ia perlu digabungkan dengan dialisis menyeluruh (penampan HEPES) untuk menghilangkan sepenuhnya laktosa dari tapak mengikat dan memulihkan aktiviti CRD. Galectin jenis liar -1 terdedah kepada pengoksidaan dan ketidakaktifan, dan kestabilannya tetap terhad walaupun dengan kehadiran agen pengurangan (Rajah 6). Walau bagaimanapun, mutan bebas cysteine ​​dengan ketara meningkatkan kestabilan jangka panjang sambil mengekalkan aktiviti aglutinasi yang setanding dan kestabilan terma (disahkan oleh nanodsf, ITC, dan lain-lain) dengan menghapuskan pergantungan ikatan disulfida.

Rajah 6. Pencirian hidrodinamik galectin rekombinan -1 mendedahkan ketidakstabilannya

 

13. Penghapusan endotoxin

Kaedah penyingkiran endotoxin berdasarkan kromatografi afiniti termasuk kromatografi yang dikenakan secara positif (pertukaran anion), penggunaan ligan polycatic (seperti poli-l-lysine (PLL), polyamine yang tidak bergerak (polymyxin B)), dan penambahan surfact Triton x {}}. Semasa proses pembersihan, perhatikan untuk menyediakan penyelesaian penampan dengan air bebas LPS, dan gunakan lajur atau lajur baru yang hanya digunakan dalam pembersihan bebas LPS yang lain. Untuk pencemaran endotoxin, pam kromatografi/sistem bendalir boleh diinkubasi semalaman dalam 0 5m NaOH atau selama 4 jam dalam 1. 0 M NaOH. Jumlah akhir LPS dalam sampel dinilai menggunakan Limulus Amebocyte Lysate Reagent (LAL), dan ia telah disahkan sama ada di bawah had yang diperlukan untuk permohonan tertentu.

 

14. Kompleks Protein

Ekspresi dan pemurnian kompleks protein perlu dioptimumkan mengikut keadaan tertentu. Cabaran termasuk ketidakstabilan atau kesilapan subunit. Setiap subunit boleh dinyatakan secara bebas dan dipasang secara in vitro, atau diketepikan bersama untuk membentuk kompleks protein berfungsi. Reka bentuk pembinaan harus diperkenalkan dengan teliti dengan label penyucian atau pengesanan untuk mengelakkan campur tangan dengan pemasangan, terutama apabila maklumat kompleks terhad dan pengoptimuman berbilang diperlukan. Semasa proses pembersihan, integriti dan kestabilan kompleks perlu dinilai. Kaedah ini termasuk SDS-PAGE (pengesanan subunit), SEC (homogenitas), SEC-MALS (analisis massa molar), fotometri massa atau spektrometri massa semulajadi (pengesahan massa). Harus diingat bahawa kompleks itu boleh memisahkan kepekatan yang rendah. Pada masa ini, kaedah kromatografi atau penampan (seperti melalui hanyutan terma atau keadaan pemeriksaan DSF) perlu dioptimumkan. Tambahan pula, mengurangkan langkah -langkah pembersihan dapat menghalang kehilangan subunit interaksi yang lemah dan mengimbangi kecekapan pembersihan dan integriti kompleks.

 

 

 

15. Pembersihan kompleks antigen-antibodi

Kompleks antigen antibodi adalah contoh biasa kompleks protein. Penyelarasan bersama mereka boleh mendedahkan corak mengikat dan membimbing pengoptimuman kejuruteraan antibodi. Kaedah tradisional memerlukan pemurnian antigen dan antibodi yang berasingan dan kemudian mencampurkannya. Walau bagaimanapun, kajian baru-baru ini telah menunjukkan bahawa strategi ekspresi dan penyebaran bersama lebih cekap. Hanya satu pembersihan yang diperlukan untuk mendapatkan kompleks, dan pada masa yang sama, antigen yang tidak stabil boleh stabil melalui antibodi, dan juga ekspresi bebas label dapat dicapai. Dalam keadaan khusus ini, penapisan SDS-PAGE dan gel (SEC) biasanya mencukupi untuk menilai kesucian dan kualiti kompleks.

 

Ringkasan

Pembersihan protein adalah teknologi asas dalam penyelidikan saintifik. Pengeluaran protein skala akademik biasanya mengikuti strategi standard dan boleh menghasilkan kemelut tinggi miligram, protein larut, yang digunakan secara meluas dalam biologi struktur, biokimia dan penyelidikan fungsional. Walau bagaimanapun, keperluan khas aplikasi hiliran (seperti keperluan untuk endotoksin dalam eksperimen haiwan dan tiada pencemaran nukleus dalam penyelidikan asid nukleik) atau ciri -ciri protein yang wujud (seperti pengagregatan mudah, yang mengandungi ikatan disulfida atau pertalian asid nukleik yang tinggi) sering memerlukan penyelesaian tersuai. Kajian ini, sebagai tindak balas kepada keadaan khas ini, mencadangkan strategi halus dari pemilihan sistem ekspresi, reka bentuk pembinaan (mengoptimumkan label dan sempadan domain) kepada proses pembersihan, dan memperkenalkan kawalan kualiti (seperti SEC, SDS-PAGE, pengesanan aktiviti, dan lain-lain) pada langkah-langkah utama. Sesetengah aplikasi juga memerlukan analisis tambahan (seperti pengesanan endotoxin dan penentuan residu asid nukleik), sama dengan konsep "jaminan kualiti" (QA) dalam industri biopharmaceutical, iaitu, untuk mencegah kecacatan melalui proses sistematik. Dengan merumuskan garis panduan kawalan kualiti dan menjelaskan piawaian khusus untuk reagen protein yang digunakan dalam penyelidikan saintifik, matlamatnya adalah untuk mewujudkan norma pemurnian protein yang lebih ketat untuk makmal akademik, meningkatkan kebolehpercayaan dan kebolehulangan data eksperimen, dan menjembatani jurang antara penyelidikan asas dan standard perindustrian.

 

Doi: 10.1186/s 12934-022-01778-5