Teknologi Membran Dan Penjelasan Vaksin (Ⅰ)

Vaksin datang daripada pelbagai sumber, termasuk ekstrak tisu, sel bakteria, zarah virus, protein dan asid nukleik yang dihasilkan oleh sel rekombinan mamalia, yis dan sel serangga.

Kaedah pengeluaran vaksin yang paling biasa adalah berdasarkan proses penapaian awal diikuti dengan penulenan. Pengeluaran vaksin ialah proses kompleks yang melibatkan pelbagai langkah dan proses. Memilih kaedah penulenan yang betul adalah penting untuk mencapai ketulenan produk akhir yang diingini. Penjelasan vaksin merupakan langkah penting yang mempunyai kesan ketara ke atas pemulihan produk dan penulenan hiliran seterusnya. Beberapa teknik boleh digunakan untuk menjelaskan vaksin. Pilihan kaedah pengumpulan dan peralatan bergantung pada jenis bateri, sifat produk yang dikumpul dan cecair proses. Teknik ini termasuk penapisan membran (penapisan mikro, penapisan aliran tangen), sentrifugasi, dan penapisan dalam (penapisan aliran normal). Dari pengalaman yang panjang, penjelasan penuaian vaksin biasanya dicapai dengan sentrifugasi diikuti dengan penapisan dalam.

 

Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, teknik berasaskan membran telah mendapat perhatian dalam penjelasan vaksin. Proses huluan semakin menggunakan teknologi pakai buang, jadi strategi penuaian mesti berubah. Artikel ini memberikan gambaran menyeluruh tentang teknologi berasaskan membran yang berbeza dan aplikasinya dalam penjelasan vaksin.

 

01 Pengenalan

Vaksin adalah komponen penting dalam pencegahan penyakit berjangkit kita, yang kekal sebagai punca kematian yang mengejutkan. Antara 2 dan 3 juta orang diselamatkan daripada difteria, tetanus, batuk kokol dan campak setiap tahun berkat imunisasi. Vaksin merangkumi pelbagai jenis, daripada protein rekombinan kecil kepada keseluruhan zarah virus dan keseluruhan bakteria. Ia boleh dihasilkan oleh sistem yang berbeza: telur, sel mamalia, bakteria, dll. Oleh kerana kerumitan dan kepelbagaian vaksin, pada masa ini tiada protokol atau templat penulenan arus perdana, walaupun minat yang semakin meningkat dalam platform vaksin.

 

Lazimnya, proses vaksin boleh dibahagikan kepada tiga bahagian: huluan (pengeluaran dan penjelasan), rawatan hiliran (pemurnian termasuk ultraturasan, kromatografi dan rawatan kimia), dan perumusan (operasi pengisian akhir). Tanpa sistem pengeluaran, penjelasan (penyingkiran awal bahan yang tidak diingini) memainkan peranan penting dalam menentukan proses penulenan yang mantap. Langkah penjelasan yang betul terutamanya membuang keseluruhan sel, serpihan sel, koloid, dan agregat besar untuk mengurangkan beban pemprosesan hiliran. Dalam sesetengah kes, penjelasan juga boleh mengurangkan kekotoran tidak larut, protein sel perumah (HCP), dan asid nukleik sel perumah. Seperti mana-mana langkah penulenan lain, langkah penjelasan perlu dioptimumkan untuk mencapai hasil dan ketulenan produk maksimum sambil menyesuaikan diri dengan kekhususan dan kekangan pengeluaran vaksin.

 

Disebabkan oleh kepelbagaian jenis vaksin, pelbagai teknik digunakan untuk penjelasan, termasuk sentrifugasi atau penapisan (Jadual 1).

 

Beberapa siri operasi biasanya diperlukan untuk mencapai penjelasan yang dikehendaki. Operasi pertama direka untuk mengeluarkan zarah yang lebih besar (penjelasan utama) dan operasi kedua direka untuk mengeluarkan koloid dan zarah sub-mikron lain (penjelasan sekunder). Sentrifugasi berkelajuan rendah berfungsi sebagai pilihan penjelasan sekali sahaja, membolehkan sel dan serpihan sel dikeluarkan oleh pemendakan. Emparan boleh mengendalikan beban pepejal yang tinggi dan telah digunakan secara meluas dalam mod kumpulan atau berterusan dan emparan cakera. Ia memerlukan pelaburan modal yang tinggi dan kos penyelenggaraan, dan menghadapi cabaran dalam meningkatkan skala kerana kekurangan model pengurangan skala yang boleh dipercayai. Walau bagaimanapun, sesetengah pengeluar vaksin komersial menggunakan emparan dalam pengeluaran berskala besar yang melibatkan jumlah pemprosesan yang tinggi dan lebih banyak aktiviti pengeluaran.

 

Penapisan klarifikasi boleh dilakukan dengan penapisan aliran biasa (NFF, juga dikenali sebagai penapisan hujung mati) atau penapisan aliran tangen (TFF, juga dikenali sebagai penapisan aliran silang). Terdapat juga mod penapis khusus (penapis dalam) yang mengandungi bahan bercas positif dan penapis AIDS yang meningkatkan pengekalan serpihan sel, koloid dan komponen yang tidak diingini bercas negatif.

 

Penapis membran mengekalkan zarah mengikut pengecualian saiz dan tidak mempunyai kapasiti pengekalan kotoran yang tinggi, jadi ia sesuai untuk langkah penjelasan sekunder. Kedua-dua penapis dalam dan penapis membran adalah mudah untuk skala dan dilaksanakan (reka bentuk sistem yang mudah). Tidak seperti NFF, TFF digunakan terutamanya untuk penjelasan primer (mikrofiltrasi). Membran dengan julat terputus 0.1-0.65 μm (sebaik-baiknya dengan saluran terbuka) telah berjaya digunakan untuk mengekalkan sel, serpihan sel dan bahan cemar besar yang lain. Kebanyakan peralatan TFF boleh berskala secara linear dan boleh digunakan semula selepas pembersihan, yang mengurangkan kos bahan habis guna untuk langkah tersebut dengan ketara.

 

Langkah penjelasan terletak di antara proses huluan dan hiliran dan kadangkala diabaikan semasa pembangunan proses vaksin kerana masa dan sumber diutamakan untuk langkah penulenan lain, seperti kromatografi atau sentrifugasi kecerunan ketumpatan.

 

Malah paten untuk proses pembuatan vaksin sering meninggalkan langkah penjelasan. Kecekapan penjelasan secara langsung mempengaruhi prestasi proses hiliran. Langkah penjelasan yang kurang dioptimumkan boleh menjejaskan kapasiti penapis yang disterilkan secara negatif atau boleh memendekkan hayat perkhidmatan resin kromatografi. Hari ini, jangkaan kawal selia yang lebih ketat cenderung menjadikan pengeluar vaksin menghasilkan vaksin yang lebih tulen, bercirikan baik tetapi berpatutan. Dalam kes ini, setiap langkah perlu diberi perhatian yang sewajarnya. Aliran semasa mencadangkan bahawa proses huluan sedang bergerak ke arah sistem ekspresi "lebih bersih" (iaitu sel yang dikultur dalam media bebas serum menggantikan telur) dengan peningkatan produktiviti dan ketumpatan sel yang lebih tinggi.

 

Proses penulenan hiliran sedang dipermudahkan dan diperkemas untuk meningkatkan ketulenan produk akhir. Untuk mengendalikan perubahan ini, langkah penjelasan tidak boleh menjadi halangan. Dalam kes ini, teknologi penapisan memenuhi cabaran penjelasan baharu, menangani isu peningkatan fleksibiliti proses, kemungkinan penggunaan tunggal dan mengurangkan kos pelaburan.

 

02 Penjelasan vaksin virus

Beberapa jenis kaedah penjelasan, sama ada bersendirian atau gabungan, telah berjaya digunakan untuk menjelaskan penuaian pada akhir suapan vaksin.

Skala perintis :1-20L, skala pengeluaran: lebih daripada 20L

 

2.1 Langkah berjaga-jaga untuk penjelasan vaksin virus

Banyak vaksin mengandungi semua atau sebahagian daripada zarah virus untuk membentuk imuniti terhadap jangkitan virus. Mereka biasanya jatuh ke dalam empat kategori luas:

Vaksin dilemahkan hidup (LAV), yang berasaskan kepada strain virus yang lemah untuk mengurangkan virulensinya. Virus yang dilemahkan boleh mereplikasi dalam badan tetapi tidak bersifat patogen.

- Vaksin virus (IV) yang tidak aktif, yang mengandungi virus tidak aktif secara kimia atau ultraviolet untuk menghapuskan kejangkitan. Zarah virus boleh lengkap, dibahagikan atau ditulenkan (protein antigen sahaja).

- Vaksin vektor virus (VV) ialah virus aktif, bukan patogen yang membentangkan antigen virus patogen. Struktur yang dibangunkan baru-baru ini juga digunakan untuk aplikasi terapi gen.

Vaksin zarah seperti virus (VLP), kelas khusus vaksin subunit virus yang meniru struktur keseluruhan zarah virus tetapi tidak mengandungi bahan genetik berjangkit.

 

Dalam kebanyakan kes, zarah virus benar-benar utuh semasa langkah penjelasan, walaupun semasa lisis vaksin virus (pembelahan biasanya dilakukan di hilir, dalam persekitaran yang lebih suci).

Cabaran utama klarifikasi virus ialah pemulihan zarah virus hasil tinggi sambil mengeluarkan serpihan sel, agregat besar dan bahan cemar tidak larut dengan cekap. Seperti yang diterangkan dalam bahagian berikut, terdapat beberapa faktor yang boleh menyebabkan kemerosotan atau kehilangan virus. Di samping itu, hasil virus boleh menjadi sukar untuk bergantung kerana kebolehubahan yang tinggi kaedah ujian kuantitatif virus pada peringkat proses ini, terutamanya untuk vaksin LAV dan VV. Untuk vaksin ini, hasil virus sering dinilai menggunakan ujian infektiviti seperti ujian plak atau ujian TCID 50. Hakikat bahawa sesetengah sebatian yang dituai mungkin mengganggu keupayaan virus untuk menjangkiti sel yang menunjukkan peningkatan kebolehubahan pendekatan kuantitatif ini.

 

2.2 Strategi penjelasan vaksin virus

Vaksin virus sangat berbeza dalam saiz, struktur, bentuk dan sistem ekspresi (Jadual 3).

Akibatnya, secara amnya tiada templat untuk proses hilirannya, terutamanya langkah penjelasan. Secara teorinya, semua teknik yang ada (emparan berkelajuan rendah, mikrofiltrasi TFF, NFF) boleh dipilih dan berpotensi digabungkan untuk menjelaskan virus. Malah, kejayaan kaedah penjelasan dipengaruhi oleh sistem ekspresi dan sifat fizikokimia virus yang terlibat.

 

Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{{0}} sel /ml) kaedah penjelasan, menggunakan polimer kationik, mengurangkan kawasan penapisan dalam sebanyak 4 kali berbanding kaedah tradisional. Teknik ini membolehkan penuaian penapai berkapasiti besar tanpa menggunakan emparan. Begitu juga, Riske et al. menunjukkan bahawa rawatan kitosan bagi 40 kultur sel L (0.02%) yang mengandungi 1.4-2.6% pepejal membawa kepada peningkatan 7-kali ganda dalam kapasiti penapis mutlak selepas penapisan dalam.

 

Mereka juga menyebut bahawa kitosan nampaknya meningkatkan kecekapan penjelasan dengan mengaburkan zarah submikron, yang biasanya mengendap dalam emparan. Kaedah prarawatan dan pemberbukuan berkemungkinan akan terus menjadi sebahagian daripada penjelasan penapisan vaksin pada masa hadapan. Penetrant, termasuk gula, glikol, dan asid amino, lebih suka memflokulasi virus. Pemberbukuan virus dengan larutan osmotik diikuti dengan 0.2µ mikroturasan boleh digunakan sebagai proses menyeluruh untuk penulenan virus. Penetran boleh merangsang pengagregatan virus dengan mengurangkan lapisan penghidratan di sekeliling zarah untuk memflokulasi zarah virus tidak berkapsul hidrofobik dan zarah virus terkapsul. Walaupun penetrat telah ditunjukkan untuk mengumpul virus, kaedah ini berpotensi menjadi platform untuk penulenan vaksin masa hadapan, dan kebolehlaksanaannya dalam pembersihan vaksin perintis atau berskala besar belum terbukti. Kaedah prarawatan pemberbukuan, yang berkemungkinan akan terus menjadi sebahagian daripada penjelasan penapis vaksin masa hadapan, dilakukan dalam penapai 2L. Untuk berpotensi digunakan dalam operasi pengeluaran berskala besar, kaedah ini perlu disahkan pada skala perintis dan pengeluaran.

 

2.2.1 Menyatakan impak sistem

Kaedah penjelasan terutamanya bergantung pada jenis proses huluan dan sistem ekspresi, yang menentukan jenis dan tahap bahan cemar yang akan dibuang. Vaksin virus biasanya dihasilkan dalam embrio ayam oleh garisan sel berterusan mamalia atau burung atau sel baculovirus/serangga, yang merupakan sistem ekspresi yang lebih kompleks. Sesetengah jenis VLP juga boleh dihasilkan oleh sistem ekspresi heterolog lain (bakteria, yis, sel tumbuhan).

 

2.2.1.1 Virus yang dihasilkan dalam embrio ayam

Vaksin telah dihasilkan dalam telur selama beberapa dekad. Kerja ini bermula pada tahun 1931, apabila Woodruff dan Good Pasture berjaya menggunakan membran korio-allantoik telur subur sebagai substrat untuk pertumbuhan virus. Hari ini, banyak vaksin manusia dan veterinar masih dihasilkan menggunakan proses purba ini. Yang paling terkenal mungkin adalah vaksin selesema bermusim. Prinsipnya adalah untuk menyuntik telur ayam dengan virus yang menarik dan kemudian mereplikasi dalam membran korio-allantoik. Selepas pembiakan, cecair allantoik yang kaya dengan zarah virus dikumpulkan dan disucikan.

 

Cecair allantoik ialah suapan penjelas yang mencabar. Kandungan mineral dan proteinnya yang tinggi (termasuk ovalbumin) memberikan kelikatan yang tinggi. Cecair allantoik juga mengandungi sebatian tisu penting daripada embrio ayam, seperti bulu, paruh, saluran darah, atau sel darah. Disebabkan kandungan pepejal yang tinggi, sentrifugasi berkelajuan rendah adalah pilihan pilihan untuk penjelasan primer, biasanya menghasilkan kadar pemulihan kira-kira 70%. Walau bagaimanapun, penjelasan utama menggunakan teknik penapisan juga boleh dilakukan. Untuk NFF, penapis dalam berasaskan polipropilena dan selulosa mempunyai keupayaan pengumpulan cecair alantoik yang baik. Penapis permukaan yang diperbuat daripada penapis dalam berasaskan polipropilena atau selulosa boleh mempunyai kapasiti 150-210 L/m² dan mengurangkan kekeruhan aliran suapan sehingga 3 kali ganda. Peranti TFF saluran suapan terbuka juga sesuai untuk penjelasan cecair allantoik, kerana peranti ini lebih sesuai untuk kehilangan tekanan minimum melalui saluran suapan, sekali gus mengurangkan penyumbatan saluran.

 

Langkah penjelasan sekunder boleh dilakukan dengan mudah dengan NFF. Gabungan bahan polipropilena, selulosa dan gentian kaca secara amnya menunjukkan kecekapan yang baik, dan alternatif kepada langkah penjelasan sekunder ialah menggunakan TFF dan {{0}}.65μm atau 0.45μm peranti membran penapisan mikro dan mengendalikan fluks osmotik kawalan. Peranti TFF saluran terbuka dengan PVDF hidrofilik atau membran PES hidrofilik boleh digunakan dalam langkah ini.

Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa zarah virus mungkin dikaitkan dengan bahan serpihan tidak larut, yang boleh mengurangkan pengeluaran virus dengan ketara semasa penjelasan. Menggunakan larutan garam boleh mengurangkan perkaitan ini antara virus influenza dan serpihan pepejal, mengakibatkan peningkatan kira-kira dua kali ganda dalam pengeluaran tanpa menjejaskan integriti zarah virus.

 

2.2.1.2 Virus yang dihasilkan dalam sel mamalia dan burung berturut-turut

Baru-baru ini, beberapa vaksin virus telah beralih daripada proses berasaskan telur dan memihak kepada proses berasaskan kultur sel (terutama untuk vaksin influenza). Sebab utama suis ini adalah untuk mengelakkan masalah pengeluaran vaksin yang berkaitan dengan telur embrio (iaitu kekurangan bekalan telur yang mungkin berlaku sekiranya berlaku sebarang wabak penyakit ayam). Akibatnya, banyak jenis vaksin dan vektor virus sedang dibangunkan menggunakan garisan sel berterusan daripada mamalia atau burung, garisan sel konvensional (seperti garisan sel Vero, MDCK atau HEK293), atau garisan sel proprietari.

 

Bergantung pada sistem ekspresi, virus mungkin kekal di dalam sel, memerlukan langkah lisis sel, atau mungkin tinggal di luar sel (lisis atau tunas). Beban pepejal dan kandungan larut yang diperoleh daripada kultur sel jauh lebih bersih daripada fasa cecair alantoik. Hasilnya, teknologi NFF lebih mudah dilaksanakan dan kapasitinya jauh lebih tinggi. Walau bagaimanapun, kapasiti penapisan sangat bergantung pada keadaan kultur sel, seperti ketumpatan sel atau daya maju sel semasa penuaian. Parameter ini mempengaruhi jumlah serpihan sel dan makroagregat yang boleh menyumbat penapis dan membran dalam, mengakibatkan kapasiti berkurangan.

 

Thomassen et al memberikan contoh penjelasan NFF yang baik. Digunakan dalam proses pengeluaran virus polio tidak aktif (IPV). Sel Vero yang dibiakkan pada pembawa mikro digunakan untuk pembiakan virus dengan ketumpatan sel {{0}}.78 x 106 sel /ml TOI. Skrin keluli tahan karat 75μm digunakan untuk pra-penjelasan untuk mengeluarkan pembawa mikro daripada penuaian. Penggredan dua lapisan dijelaskan menggunakan penapis dalam ketumpatan (0.2-2.0μm), diikuti dengan penapis gred yang disterilkan.

Unit pakai buang boleh berskala terpilih telah berjaya digunakan untuk penyediaan bahan percubaan klinikal Sabin IPV pada skala 350 L. Bergantung pada serotype virus, kadar pemulihan virus sebanyak 86 hingga 96 peratus diperoleh.

 

2.2.1.3 Baculovirus/zarah seperti virus yang dihasilkan dalam sistem sel serangga

Pertimbangan sistem sel baculovirus/serangga untuk pengeluaran vaksin berskala besar agak baru, tetapi menarik minat yang semakin meningkat dalam bidang vektor virus dan VLP. Faedah utama sistem ini ialah ia melibatkan pengeluaran jangka pendek (tidak perlu membina talian sel) dan selamat (tiada DNA virus yang lengkap). Terdapat juga beberapa kelemahan, seperti keperluan untuk penyingkiran baculovirus dan kestabilan produk.

 

Cervarix, vaksin VLP terhadap jangkitan papillomavirus manusia yang dihasilkan oleh GlaxoSmithKline, ialah vaksin manusia pertama yang dihasilkan secara komersial dalam sel serangga. Sejumlah vaksin berdasarkan VLP dan vektor rAAV yang dihasilkan dalam sel serangga yang dijangkiti baculovirus sedang dalam pembangunan. Garisan sel serangga yang diperolehi daripada cacing tentera musim luruh Spodoptera frugiperda (Sf9 dan Sf21) dan kubis bendworm Trichoplusia ni (sel BTI-TN5B1-4) adalah yang paling biasa digunakan kerana keupayaannya untuk tumbuh dalam ampaian, yang memudahkan penguatan bahagian hulu. proses. Selepas berkembang kepada ketumpatan sel hidup yang dikehendaki, sel-sel ini dijangkiti baculovirus rekombinan dalam fasa pertumbuhan sel eksponen untuk ekspresi protein. Genom besar baculovirus membolehkan ekspresi lima atau lebih protein berbeza, yang sepadan dengan kerumitan VLP dan vektor virus.

 

Bernard et al. menerangkan proses hiliran kultur sel serangga. Prosesnya sangat berubah-ubah, mencerminkan kepelbagaian protein yang dihasilkan dengan teknik ini. Langkah pertama jujukan penulenan banyak dipengaruhi oleh ciri isipadu bioreaktor (iaitu, ketumpatan sel dan daya maju), atau oleh sifat pelepasan produk (dirahsiakan oleh tunas atau lisis sel). Jangkitan Baculovirus pada sel serangga boleh menyebabkan lisis sel dalam masa 3-5 hari. Pemusnahan sel boleh menyebabkan peningkatan dalam aktiviti proteolitik dan faktor persekitaran lain yang boleh membawa kepada degradasi protein rekombinan.

Terdapat percubaan untuk membangunkan baculovirus dengan keupayaan yang lebih rendah untuk memulakan lisis sel. Baculovirus melisiskan kurang daripada 10 peratus serangga yang dijangkiti.

 

Lisis sel boleh dilakukan menggunakan kaedah yang berbeza, seperti pencairan beku, detergen, homogenizer, atau rawatan ultrasound. Sel serangga tidak mempunyai dinding sel dan oleh itu larut dengan cepat. Walaupun rawatan ultrasonik telah dilaporkan dalam banyak proses bangku, ia jarang digunakan pada skala eksperimen atau komersial. Kaedah yang paling biasa ialah menggunakan homogenizer untuk memusnahkan sel dengan kehadiran detergen kepekatan rendah (0.1% Triton X-100 atau NP-40). Penggunaan detergen dan mikrobendalir atau homogenisasi kesan osmotik telah berjaya digunakan dalam banyak proses pembuatan berskala besar. Biasanya, sel serangga digantung dalam penimbal lisis (50 mM TRIS pH7.7, 300 mM NaCl, 5% gliserol, 0.2 mM PMSF dan perencat protease), di mana Triton-X100 ditambah kepada kepekatan akhir 0.1%, diikuti dengan ultrabunyi ringan atau mikrobendalir. Campuran kemudiannya disentrifugasi untuk mengeluarkan zarah tidak larut.

 

Pada peringkat ini, lisat mungkin kelihatan sangat keruh dan sukar untuk ditapis menggunakan penapis 0.45μm. Kadangkala kerugian sehingga 30% boleh diperhatikan semasa langkah penjelasan pirolisis. Penambahan benzoenzim pada peringkat pembelahan membantu menyelesaikan masalah penapisan. Membersihkan sel dengan air garam penampan fosfat selepas penuaian dan "cairan beku" yang cepat dalam garam tinggi (500mM NaCl) yang mengandungi penimbal retak membantu mengeluarkan agregat.

 

Penjelasan VLP dan vektor virus yang dihasilkan oleh sel serangga berlaku selepas lisis sel (dengan rawatan kimia atau mekanikal), yang membebaskan bukan sahaja zarah virus tetapi juga sejumlah besar asid nukleik selular. Sel serangga mampu membesar pada ketumpatan sel yang tinggi, daripada 1-9.10 6 sel/ml. Oleh itu, langkah penjelasan harus berurusan dengan ketumpatan sel yang tinggi, kandungan asid nukleik yang tinggi dan, jika boleh, penyingkiran zarah baculovirus. Untuk menjadikan perkara lebih rumit, VLP atau vektor virus dan baculovirus boleh mempunyai saiz yang serupa (baculovirus ialah 60-80 lebar nanometer dan panjang 300-400 nanometer). Oleh kerana ketumpatan sel yang tinggi, sentrifugasi telah menjadi teknik pilihan untuk penjelasan primer selama beberapa dekad. Walau bagaimanapun, proses membran nampaknya merupakan alternatif yang sangat menarik kerana kebolehskalaan mudah ditentukan.

 

Penapis dalam telah digunakan dengan berkesan dalam proses hiliran zarah seperti rotavirus tiga lapisan. Di peringkat makmal, kaedah ultrasentrifugasi kecerunan ketumpatan CsCl sering digunakan untuk membersihkan zarah kompleks ini. Para penyelidik menilai bukan sahaja langkah penjelasan penapis dalam, tetapi juga keseluruhan proses hiliran (belahan Triton X-100 dan penapisan dalam, diikuti dengan ultrafiltrasi dan pengecualian saiz zarah). Keputusan menunjukkan bahawa hasil kecerunan ketumpatan CsCl boleh mencapai 37%.

Kaedah ultra-emparan ialah kira-kira 10%. Sebagai contoh lain, gentian berongga 0.45μm dan gentian diameter halus 500 kDa digunakan untuk memulihkan dan menumpukan zarah seperti HIV yang dihasilkan dalam sel serangga. Dalam kajian ini, daya ricih gentian berongga telah dioptimumkan berdasarkan integriti sel. Keputusan Proses daya ricih rendah telah diwujudkan untuk menggantikan ultrasentrifugasi kecerunan gula meja.

 

Proses ini berpotensi untuk digunakan untuk pengeluaran besar-besaran. Penapis dalam juga telah berjaya digunakan dalam penghasilan virus berkaitan adeno rekombinan. Lisis sel dilakukan dengan jammer sel mekanikal dua piston, diikuti dengan rawatan nuklease. Dalam langkah penjelasan, elemen penapis dalam gentian kaca 1.2μm digunakan, diikuti oleh dua lapisan 0.8μm PES hidrofilik dan 0.2μm PES hidrofilik. Penapis bersaiz berkadar digunakan untuk kumpulan proses daripada saiz yang lebih kecil kepada 200 L. Penapis dalam telah digunakan dengan jayanya, dan penarafan TFF dengan filem rata atau gentian berongga 0.2µm atau 0.45µm juga telah dilaporkan sangat berkesan.

 

Kajian oleh Tecnologica (IBET) di Institut Biologi Eksperimen Oeiras di Portugal menggunakan NFF untuk melakukan penjelasan hepatitis C VLP yang dinyatakan oleh baculovirus tanpa sentrifugasi. Penapis polipropilena yang dinilai secara nominal (10,5,0.6 dan 0.3μm) digunakan untuk menjelaskan penuaian VLP. Penapis yang sama dengan 0.6μm dan 0.3μm penarafan liang digunakan untuk penapisan di pusat penuaian VLP. Semua turasan yang dikaji telah diuji untuk kadar pemulihan HCV-VLP dan kaedah penapisan yang disyorkan telah dibandingkan. Keputusan ditunjukkan dalam Jadual 4.

Keputusan menunjukkan bahawa penapis 5μm-0.3μm mempunyai pemulihan produk tertinggi (100%) untuk suapan hepatitis C VLP yang dituai terus. Penapis polipropilena 0.6μm mempunyai pemulihan produk tertinggi (82%) untuk suapan pusat, dan pelepasan DNA sel hos adalah kira-kira 70%.

 

2.2.1.4 Zarah seperti virus yang dihasilkan dalam sistem bakteria atau yis

Jenis kaedah penjelasan untuk vaksin VLP yang dinyatakan dalam sistem bakteria atau yis bergantung pada pembebasan VLP kepada mediator ekstraselular. Jika VLP tidak dapat dirembeskan dengan cekap, lisis sel atau langkah pengekstrakan lain mungkin diperlukan sebelum langkah penjelasan sebenar. Walaupun ini adalah piawaian emas dalam industri penjernihan protein, sentrifugasi (berterusan atau kelompok) yang dinyatakan dalam sistem berasaskan bakteria atau yis, baru-baru ini, proses membran telah menjadi alternatif yang sangat menarik kerana mudah berskala dan keserasian dengan penggunaan tunggal. rawatan.

 

Richter dan Topell menerangkan penggunaan sentrifugasi, TFF, atau gabungan kedua-duanya semasa menyediakan VLP yang dihasilkan dalam E. coli yang dijelaskan. Dalam kerja mereka, 0.45m TFF membran telah digunakan untuk mencairkan dan menjelaskan homogenat E. coli homogenat pada suhu 5 darjah . Mereka juga ambil perhatian bahawa TFF berasaskan membran sesuai untuk mengendalikan penuaian kelikatan tinggi, sebaik-baiknya menggunakan unit TFF dengan konfigurasi saluran terbuka.

Penjelasan sentrifugal juga telah dinilai sebagai alternatif kepada TFF. Dalam kes ini, homogenat yang terhasil tidak dicairkan dan disentrifugasi pada 4 darjah selama 105 minit, 10000g. Tanpa memindahkan salutan lembut, supernatan dituangkan keluar dari zarah dan disentrifugasi semula pada 4 darjah dan 10,000 g selama 60 minit. Supernatan itu kemudiannya dikeluarkan daripada zarah yang ada, dicairkan dengan penimbal EB (43.89 mM Tris HCl, 6.11 mM Tris Base, 5.0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 dan ditapis pada peranti penapis steril 0.22 m. Pemprosesan lanjut. Proses peningkatan skala untuk pengeluaran vaksin VLP ini dalam E. coli pada skala 800L juga dilaporkan dijelaskan oleh gabungan sentrifugasi dan TFF.

 

Vaksin hepatitis E rekombinan HEV 239 telah dilesenkan di China untuk mengimunkan orang dewasa berumur 16 tahun ke atas. Antigen vaksin (VLP) dinyatakan dalam E. coli, dan penskalaan proses penghasilan antigen telah ditunjukkan pada skala 50L. Produk telah diekstrak dengan memecahkan E. coli dan badan kemasukan diasingkan daripada serpihan sel dengan membasuh berat dengan penimbal yang mengandungi 2% Triton X-100 dan kemudian dilarutkan dengan homogenizer urea 4 M. TFF menjelaskan VLP virus papilloma manusia yang dihasilkan dalam Saccharomyces cerevisiae (15L). Lisat sel yang dirawat dengan nuklease telah dijelaskan oleh penapisan mikro aliran silang dalam mod transfiltrasi menggunakan penapis gentian berongga 0.65 μm. Proses yang sama digunakan dalam pengeluaran vaksin. Walaupun hanya segelintir vaksin berasaskan VLP telah mencapai skala komersial, beberapa vaksin berasaskan VLP sedang dibangunkan, kebanyakannya dijelaskan menggunakan teknologi sentrifugasi atau membran.

 

Terhad oleh pengaruh ruang, kami akan berkongsi separuh kedua kandungan dalam bab seterusnya. Dalam artikel seterusnya, kami akan berkongsi beberapa kes penjelasan vaksin dan penggunaan komponen membran yang berkaitan.

 

Sebagai syarikat pertama dalam litar penyetempatan, Teknologi Guidling telah mengumpul pengalaman relevan yang mencukupi dalam penjelasan vaksin. Guidling Technology ialah syarikat pembangunan dan pengeluaran yang memfokuskan pada biofarmaseutikal dan kultur sel, penulenan dan pengasingan. Produk digunakan secara meluas dalam bioperubatan, diagnosis, penapisan cecair industri, pengesanan, penjelasan, penulenan dan proses penumpuan; Guidling telah berjaya membangunkan tiub emparan ultraturasan, kaset membran ultraturasan/mikrofiltrasi, penapis penyingkiran virus, peranti penapis aliran tangen, susunan membran dalam, dsb., yang memenuhi sepenuhnya senario aplikasi biofarmaseutikal dan kultur sel.

 

Membran dan penapis membran kami digunakan secara meluas dalam kepekatan, pengekstrakan dan pengasingan pra-penapisan, penapisan mikro, ultraturasan dan penapisan nano. Rangkaian produk kami yang luas, daripada penapisan makmal sekali guna kecil kepada sistem penapisan jenis pengeluaran, ujian kemandulan, penapaian, kultur sel dan banyak lagi, boleh memenuhi keperluan ujian dan pengeluaran.