Kajian Mengenai Proses Penjelasan Lysate Fermentasi Ketumpatan Tinggi Escherichia Coli Rekombinan
Untuk mengurangkan gangguan cecair bahan kepada kromatografi dan meningkatkan pemulihan protein sasaran, proses penjelasan lysate penapaian ketumpatan tinggi dua strain Escherichia coli rekombinan telah dikaji. Strain BL21-HP1036 dan BL21-palA yang menyatakan gen utama Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis telah dipilih. Proses aliran tangensial, proses sentrifugasi berkelajuan tinggi dan proses penjelasan kaset membran digunakan untuk menilai hasil protein melalui pengesanan kekeruhan dan elektroforesis.
Keputusan menunjukkan bahawa BL21-HP1036, BL21-palA lisat penapaian ketumpatan tinggi yang mengekspresikan gen utama Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis telah dijelaskan melalui penapisan dan sentrifugasi kaset membran, dan hasil protein melebihi 80%, yang berkesan boleh mengurangkan gangguan kromatografi dan meningkatkan kadar pemulihan.
pengenalan
Pada masa ini, Streptococcus suis (SS) dan Haemophilus parasuis (HPS) adalah patogen penyakit bakteria yang paling biasa di ladang babi, yang membawa kerugian besar kepada industri babi. SS boleh dibahagikan kepada sejumlah 35 serotaip 1-34 dan 1/2, dan HPS boleh dibahagikan kepada 1-15 serotype, dan kedua-duanya sering bercampur, terutamanya menyebabkan poliserositis babi, arthritis, meningitis, endokarditis , septikemia bakteria dan bronkitis.
Disebabkan bilangan besar serotaip Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis, perlindungan silang antara serotaip yang berbeza adalah lemah, dan rintangan antibiotik akan meningkat dengan ketara apabila dirawat dengan antibiotik, yang akan menjejaskan kesan terapeutik.
Vaksin telah menjadi salah satu cara yang berkesan untuk mencegah SS dan HPS. Terdapat vaksin yang tidak aktif, vaksin yang dilemahkan, vaksin hidup, vaksin subunit dan vaksin kejuruteraan genetik, tetapi vaksin yang tidak aktif dan vaksin yang dilemahkan terdapat terutamanya di pasaran, dan perlindungan imunnya adalah baik, tetapi perlindungan silang tidak jelas. Vaksin subunit ialah jenis vaksin baharu terhadap streptokokus suis, iaitu jenis vaksin baharu dengan perlindungan silang yang kuat dan harga yang rendah. Penyelidikan dan pembangunan vaksin subunit Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis menyediakan penyelesaian yang sempurna kepada masalah pencegahan dan kawalan Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis yang melanda industri babi di China.
Vaksin subunit Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis tertakluk kepada penapaian ketumpatan tinggi oleh Escherichia coli rekombinan. Penjelasan lysate mempunyai kesan yang besar terhadap hasil protein sasaran, tetapi terdapat beberapa laporan yang berkaitan. Bagaimana untuk merealisasikan langkah penjelasan proses penapaian dan penulenan adalah kerja yang penting. Dalam kertas kerja ini, rekombinan E. coli BL21-HP1036, BL21-palA penapaian berketumpatan tinggi sebagai objek, untuk mengkaji cara mengurangkan kekeruhan larutan penjernih dengan cekap, meningkatkan hasil protein, untuk Proses penapaian vaksin subunit Streptococcus suis untuk mencapai teknologi penghancuran dan penjelasan industri untuk menyediakan asas teori dan sokongan teknikal.
1. Bahan dan kaedah
1.1 Bahan
1.1.1 Terikan
Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis strain BL21-HP1036, BL21-pa-lA
1.1.2 Media utama dan reagen
Ekstrak yis dan ikan lumba-lumba; Natrium klorida; Kanamycin, IPTG; Formaldehid daripada; Kit gel SDS-PAGE.
1.1.3 Peralatan ujian utama
Penapai ketumpatan tinggi; Emparan berkelajuan tinggi; radas elektroforesis; Sistem pengimejan gel ultraviolet; Penghancur ultrasonik; Empar berkelajuan tinggi kecil; Spektrofotometer ultraungu; Meja goncang suhu malar; Peralatan kromatografi afiniti.
1.2 Kaedah
1.2.1 Budaya penapaian berketumpatan tinggi
Strain koliform rekombinan yang layak BL21-HP1036 dan BL21-pa-lA telah diinokulasi pada medium sintetik pada 2%(V/V) dan dikultur pada 37 darjah selama 35-40 h.
1.2.2 Ekspresi teraruh protein rekombinan
Apabila larutan penapaian OD{{0}}±0.1, aruhan bermula, suhu aruhan ialah 35 darjah ±0.5 darjah, dan kultur ditamatkan selepas 10j aruhan.
1.2.3 Penghancuran dan sentrifugasi homogen tekanan tinggi
Cecair bakteria yang lulus ujian penyahaktifan masing-masing dihancurkan oleh homogenizer tekanan tinggi untuk keretakan sel, dengan tekanan 100~150 MPa. Selepas dihancurkan, cecair yang dihancurkan disimpan pada suhu rendah.
Supernatan diperoleh dengan mengempar dengan kelajuan tinggi, kelajuan emparan: 15000 rpm, kawalan suhu:10 darjah ~15 darjah, kelajuan suntikan:0.5~1 L/min, masing-masing, supernatan dikumpulkan, dan supernatan diisi dengan bekas yang mengeluarkan endotoksin.
1.2.4 Penjelasan kaset membran penapisan mikro
Membran telah dibasuh dengan 10L air yang telah disucikan dalam satu arah, dan penapisan aliran tangen telah dijalankan. 300 mL ampaian bakteria yang pecah selepas sentrifugasi diambil dari emparan saluran paip dan diperjelaskan dengan kaset membran penapisan mikro 0.45um. Kekeruhan diukur dengan pensampelan masing-masing, dan kekeruhan selepas sentrifugasi, kekeruhan cecair yang dijelaskan dalam kaset membran penapisan mikro dan kekeruhan cecair pekat dalam kaset membran penapisan mikro dibandingkan. Kandungan protein sampel telah dikesan oleh kromatografi dan elektroforesis untuk menilai hasil protein.
Langkah 2: Keputusan
2.1 Data penjelasan dan keputusan ujian BL21-HP1036 dan BL21-protein palA
Keputusan dalam FIG. 1 menunjukkan bahawa kekeruhan BL21-HP1036 dan BL21-palA rekombinan cecair penghancur Escherichia coli menurun daripada 4 500 NTU dan 4 000 NTU kepada 1970 NTU dan 520 NTU, masing-masing, selepas sentrifugasi tiub. Kekeruhan BL21-HP1036 dan BL21-palA rekombinan Escherichia coli telah dikurangkan kepada 25 NTU dan 1.28 NTU melalui kaedah kaset membran penapisan mikro. Ia dapat dilihat bahawa penggunaan penapisan aliran tangen kaset membran mikro penapisan dan saluran aliran terbuka yang dioptimumkan mempunyai kesan yang baik ke atas mengurangkan endotoksin, kelikatan dan kekeruhan cecair kromatografi daripada penapisan emparan tradisional, dan boleh mengurangkan dengan ketara rekombinan E. coli heteroprotein patah. dan asid nukleik.
2.2 Pemulihan protein sampel BL21-HP1036 dan BL21-palA
Jadual 1 menunjukkan bahawa protein Escherichia coli BL21-HP1036 rekombinan wujud dalam kedua-dua larutan terklarifikasi mikroturasan dan supernatan pekat yang diliputi oleh membran penapisan mikro, dan jumlah hasil protein selepas mendapatkan semula protein daripada larutan terjernih mikroturasan dan supernatan pekat adalah kira-kira 88.5%. Protein BL21-palA juga wujud dalam larutan terklarifikasi eksudat mikroturasan dan supernatan larutan pekat yang diliputi oleh kaset membran penapisan mikro. Jumlah hasil protein BL21-PALa ialah 81.5%.
3. Kesimpulan
Dalam kertas ini, strain yang menyatakan gen utama BL{{0}}HP1036 dan BL21-palA Streptococcus suis dan Haemophilus parasuis masing-masing menjalani penapaian ketumpatan tinggi dan melepasi 0.45 Kekeruhan cecair bahan adalah dikurangkan dengan ketara oleh proses kaset membran mikro penapisan um, menunjukkan bahawa teknologi penapisan aliran tangen dengan kaset membran penapisan mikro adalah lebih baik daripada itu dengan emparan berkelajuan tinggi, dan boleh mengurangkan protein kekotoran dan asid nukleik rekombinan Escherichia coli dengan ketara.
Selepas mengumpul cecair jernih dalam kaset membran penapisan tunggal tunggal, terdapat 62.9% Sebagai 37.1% daripada protein sasaran BL21-HP1036 ialah pekat penapisan mikro atau wujud dalam kaset membran penapisan mikro dan kerugian lain , kaedah dua langkah telah diterima pakai untuk penjelasan. Dalam langkah pertama, kaset membran penapisan mikro 0.45um digunakan untuk menjelaskan dan mengumpul eksudat; dalam langkah kedua, baki cecair pekat dikumpul selepas pengemparan tiub, dan cecair terklarifikasi dua langkah digabungkan sebagai sampel kromatografi Nilai kekeruhan cecair penapaian BL21-palA tidak meningkat dengan ketara, hasil protein boleh mencapai lebih daripada 85.5%, dan hasil protein BL21-cecair penapaian Pala boleh mencapai 81.5% selepas rawatan dua langkah.
Mengenai cara memilih kaset membran penapisan mikro, Teknologi Guidling boleh memberi anda penyelesaian berkualiti tinggi. Produk siri kaset membran penapisan mikro dan kaset membran ultraturasan kami menggunakan polieter sulfon sebagai pembawa, direka khas untuk bioteknologi. Membran polieter sulfon kami mempunyai kelebihan daya pemprosesan yang tinggi, penjerapan protein yang rendah, kekuatan mekanikal yang tinggi, rintangan hentaman dan sebagainya. Kami menyediakan anda dengan pengapit membran khas untuk mengukur tekanan salur masuk dan alur keluar dalam masa nyata, dan boleh menyediakan lawatan teknikal mengikut keperluan anda untuk menyesuaikan sistem ultraturasan/mikroturasan khas anda. Sistem aliran tangen kecil sedemikian boleh digunakan untuk pengeluaran kecil, perintis dan berskala kecil, dan boleh menjadi penguatan linear sepenuhnya untuk memenuhi sepenuhnya keperluan ujian dan keperluan pengeluaran anda.
Mengenai Guidling
Guidling Technology ialah perusahaan teknologi tinggi negara yang memfokuskan pada biofarmaseutikal, kultur sel, penulenan dan kepekatan bioperubatan, diagnosis dan cecair industri. Kami telah berjaya membangunkan peranti penapis emparan, kaset penapisan ultra & mikro, penapis virus, sistem TFF, penapis kedalaman, gentian berongga, dsb. Yang memenuhi sepenuhnya senario aplikasi biofarmaseutikal, kultur sel, dan sebagainya. Membran dan penapis membran kami digunakan secara meluas dalam kepekatan, pengekstrakan dan pengasingan pra-penapisan, penapisan mikro, ultraturasan dan penapisan nano. Barisan produk kami yang banyak, daripada penapisan makmal sekali guna kecil kepada sistem penapisan pengeluaran, ujian kemandulan, penapaian, kultur sel dan banyak lagi, memenuhi keperluan ujian dan pengeluaran. Teknologi Guidling tidak sabar-sabar untuk bekerjasama dengan anda!
