Penggunaan Ultrafiltrasi Dalam Penghasilan Vaksin Rabies Manusia

Untuk menggalakkan penggunaan ultrafiltrasi dalam penghasilan vaksin rabies manusia, kaset membran ultrafiltrasi 300kDa digunakan untuk menumpukan penyelesaian penuaian virus rabies dan mengesan pemulihan antigen, kadar penyingkiran endotoksin dan kadar penyingkiran protein perumah selepas ultraturasan. Keputusan menunjukkan bahawa di bawah tekanan yang sesuai, larutan penuaian virus rabies tertumpu 80 kali, dicairkan 25 kali, kadar pemulihan antigen ialah 86.2%, kadar penyingkiran endotoksin bakteria ialah 87.5% ~ 88.7%, dan kadar penyingkiran protein tuan rumah ialah 91.6%.

 

Kata pengantar

 

Rabies ialah penyakit zoonotik tradisional yang disebabkan oleh Virus Rabies (RV), dengan kadar kematian sehingga 100%. Pada masa ini, tiada rawatan berkesan untuk pasca pendedahan (iaitu kerosakan pada kulit dan membran mukus) selain daripada vaksin kecemasan dan imunoglobulin. Sumber utama rabies pada manusia adalah gigitan daripada haiwan yang berpenyakit atau berpotensi dijangkiti (terutamanya anjing). Kadar kematian rabies di China menduduki tempat kedua di dunia, dan rabies merupakan salah satu masalah yang mengancam keselamatan kesihatan awam di negara kita. Glikoprotein kapsul virus rabies, yang merupakan satu-satunya antigen utama yang mendorong pengeluaran antibodi peneutral pelindung, telah menjadi tumpuan penyelidikan dan pembangunan vaksin baharu serta teknologi diagnosis dan rawatan baharu virus rabies.

 

Virus rabies tergolong dalam genus virus rabies dari keluarga rhabdovirus. Bentuk nukleokapsid adalah anjal, nukleokapsid adalah simetri heliks, dan permukaannya mempunyai sampul yang mengandungi RNA untai tunggal. Ia adalah patogen yang menyebabkan rabies. Virus Rabies mempunyai dua antigen utama: satu ialah antigen glikoprotein pada membran luar virus, yang boleh mengikat reseptor asetilkolin untuk menjadikan virus neurotoksik, dan menghasilkan antibodi peneutral dan antibodi perencatan hemagglutinasi dalam badan, dan antibodi peneutral mempunyai kesan perlindungan; Yang lain ialah antigen riboprotein dalaman, yang boleh membuat badan menghasilkan antibodi pengikat pelengkap dan precipitin, dan tidak mempunyai kesan perlindungan.

 

Endotoksin adalah sejenis bahan lipopolisakarida (LPS), yang mempunyai rintangan haba dan kestabilan kimia dan tidak mudah dimusnahkan. Sekiranya terdapat kepekatan tertentu endotoksin dalam vaksin, ia akan menyebabkan demam yang teruk dan juga kematian selepas vaksinasi, jadi kandungan endotoksin dalam vaksin perlu dikurangkan sebanyak mungkin. Edisi 2005 Chinese Pharmacopoeia (Bahagian III) menentukan bahawa nilai kawalan indeks kelayakan endotoksin vaksin rabies tidak boleh lebih tinggi daripada 100EU/ dos. Dengan perkembangan pesat teknologi pemisahan membran, aplikasi teknologi pemisahan membran ultrafiltrasi untuk mengurangkan kandungan endotoksin dalam vaksin semakin meluas dalam industri farmaseutikal.

 

Vaksin rabies ialah vaksin terhadap rabies. Biasanya terdapat tiga jenis vaksin rabies, termasuk vaksin sel Vero yang telah dimurnikan, vaksin sel diploid manusia dan vaksin kultur sel primer. Vaksin rabies dibuat dengan menyuntik virus tetap virus rabies ke dalam matriks selular, selepas kultur, penuaian, penumpuan, penyahaktifan, penulenan, dan penambahan penstabil yang sesuai. Fungsi utama vaksin rabies adalah untuk merangsang badan untuk menghasilkan tindak balas imun yang cepat dan menghasilkan antibodi pelindung terhadap virus rabies, supaya dapat mencegah jangkitan yang disebabkan oleh virus dan mengurangkan risiko penyakit.

 

 

Proses penghasilan vaksin memainkan peranan penting dalam memastikan kualiti vaksin terutamanya kuantifikasi beberapa indikator dalam proses pengeluaran adalah lebih penting. Dalam proses pengeluaran vaksin rabies manusia, teknologi kepekatan ultrafiltrasi adalah cara yang diperlukan untuk menghasilkan vaksin rabies manusia. Menggunakan membran ultraturasan apertur yang munasabah untuk kepekatan ultraturasan boleh membuang endotoksin dan protein perumah dengan berkesan, dan mengekalkan antigen RV, yang kondusif untuk pengeluaran vaksin dan peningkatan kualiti. Jisim molekul relatif molekul RV ialah 350kDa ~ 460kDa, dan secara teori, RV boleh terperangkap sepenuhnya oleh kepekatan ultrafiltrasi menggunakan kaset membran dengan berat molekul pemintasan 100kDa dan 300kDa. Endotoksin sering membentuk struktur agregat dalam larutan akueus yang berbeza, kerana tahap pengagregatan, saiz molekul adalah berbeza. Jisim molekul relatif monomer endotoksin ialah 10kDa ~ 20kDa, dan jisim molekul relatif bagi bentuk pempolimerannya ialah 300kDa ~ 1000kDa atau lebih daripada 1000kDa. Berdasarkan perbezaan berat molekul, antigen RV dalam vaksin rabies manusia telah dikekalkan dan endotoksin dan protein perumah dalam vaksin rabies manusia telah dikeluarkan oleh membran ultrafiltrasi 300kDa.

 

Dalam percubaan ini, kaset membran ultraturasan dengan apertur 300kDa dan luas membran 0.11m2 digunakan sebagai rawatan sampel kecil untuk menumpukan produk perantaraan vaksin rabies manusia dan fluks membran, kecekapan rawatan, berbilang kepekatan, pemintasan antigen, penyingkiran endotoksin , dan penyingkiran protein perumah telah diuji.

 

2Kaedah Bahan

 

2.1 Bahan eksperimen

Virus Rabies virus tetap strain CTN-IV; sel Vero; 0.5M natrium hidroksida; Kaset membran ultraturasan 300kDa (bahan PES, luas membran 0.11m²).

 

2.2 Kaedah eksperimen

2.2.1 Penyediaan penyelesaian penuaian virus

Sel Vero beku telah dihidupkan semula dalam air suam pada 37 darjah ~ 39 darjah , penggantungan sel disedut keluar, dan kemudian ditambah kepada 199 medium kultur yang mengandungi 10% serum anak lembu yang tidak diaktifkan. Sel monolayer seragam telah dikultur pada 37 darjah. Strain CTN-IV telah diinokulasi dengan virus rabies pada nisbah 0.1mol/L dan dibiakkan pada 37 darjah . Selepas 48 jam, medium kultur dibuang dan 199 medium kultur yang mengandungi 0.1% albumin darah manusia ditambah untuk mengekalkan kultur pada 33 darjah ~ 35 darjah . Tuai racun penyakit sekali setiap 3d-5d, dan gabungkan berbilang cecair penuaian.

 

2.2.2 Memasang Kaset Membran

Pasang kaset membran dan sambungkan pendawaian seperti yang ditunjukkan dalam rajah di bawah.

 

2.2.3 Mencuci Air

Tutup injap masuk, injap balik dan injap melalui, dan masukkan hujung balik dan paip hujung ke dalam tangki cecair sisa. Isikan tangki pengambilan dengan 1L air untuk suntikan.

Buka injap masuk dan balik, tutup injap masuk, buka pam, bersihkan saluran balik dengan 10% isipadu air tulen atau air untuk suntikan dan kekalkan tekanan masukan pada 0.35bar (5psi).

Buka injap penapis, tutup injap balik dan gunakan baki air suntikan untuk membersihkan paip penapis, mengekalkan TMP pada 0.35bar.

 

2.2.4 Pembasmian kuman

Tutup injap masuk, injap pemulangan dan injap penghantaran, dan masukkan hujung pemulangan dan saluran hujung penghantaran ke dalam tangki cecair sisa. Isi tangki pengambilan dengan 2L larutan pembersih.

Buka injap masuk dan balik, tutup injap masuk, buka pam, bersihkan saluran balik dengan 200mL natrium hidroksida 0.5M dan kekalkan tekanan masuk pada 0.35bar (5psi) .

Buka injap melalui, tutup injap balik dan bersihkan paip melalui dengan 200mL isipadu larutan pembersih, mengekalkan TMP pada 0.35bar.

Kemudian hujung kembali dan paip melalui hujung dimasukkan ke dalam tangki cecair untuk pembersihan kitaran. Pembersihan kitaran dengan 1 ~ 1.5 kali kadar aliran tangen proses selama 30min.

Toskan 0.5M natrium hidroksida dan bilas dengan air untuk suntikan mengikut 2.2.4 sehingga neutral.

 

2.2.5 Ujian fluks air

Tambah air yang telah disucikan ke dalam tangki pengambilan, ukur dan rekod suhu air dalam tangki pengambilan. Masukkan hujung kembali ke dalam tangki. Mulakan pam dan laraskan kelajuan pam dan injap balik untuk mencapai perbezaan tekanan transmembran 0.35bar (5psi). Dengan menggunakan silinder, ukur dan rekod kadar alir pada hujung melalui dalam mL/min. Laraskan kelajuan pam dan injap balik untuk mendapatkan tekanan pembezaan transmembran 1bar (15psi). Dengan menggunakan silinder, ukur dan rekod kadar alir pada hujung melalui dalam mL/min.

Untuk menyeragamkan nilai aliran air, bahagikan nilai aliran air yang dikira dengan perbezaan tekanan transmembran dan darabkan faktor pembetulan suhu dalam jadual berikut.

 

2.2.6 Kepekatan ultraturasan

Basuh air keluar dari sistem dengan bahagian atas penimbal. Kitar selama 5 minit untuk melaraskan pH dan kestabilan ion sistem. Jika suhu perlu dilaraskan, teruskan kitaran sehingga suhu sistem stabil.

Tambahkan cecair suapan ke tangki pengambilan, tetapkan kadar aliran suapan (cth 400LMH), dan uji kadar aliran melalui pada nilai TMP yang berbeza. Menurut data ujian, lengkung telah dilukis dengan TMP sebagai absis dan Fluks sebagai ordinat.

Arahkan paip melalui hujung ke dalam bekas atau longkang yang sesuai, seperti tangki pengumpulan melalui hujung, tangki cecair sisa dan longkang proses.

Catatkan berat awal cecair suapan dalam tangki suapan, mulakan pam suapan, dan perlahan-lahan edarkan cecair suapan selama 3 minit hingga 4 minit. Edaran semula boleh membantu mengeluarkan sisa udara dalam laluan aliran, dengan itu memaksimumkan prestasi filem.

Buka injap melalui, perlahan-lahan tingkatkan kelajuan pam sehingga kadar aliran tangen optimum dicapai, dan laraskan injap balik untuk mencapai TMP optimum sistem.

Kemudian masukkan tiub ke dalam bekas pengumpulan, mulakan masa apabila cecair memasuki bekas, dan rekodkan tekanan masuk dan balik pada selang yang sesuai, dan rekod kualiti cecair dari masa ke masa di hujung balik dan akhir untuk mengira serta-merta kadar aliran.

Kepekatan ultraturasan sampel selesai apabila isipadu cecair suapan dikurangkan kepada isipadu kepekatan sasaran.

 

2.2.7 Dialisis

Letakkan paip pengambilan, paip penambahan dan paip kembali ke dalam tangki pengambilan, masukkan paip penghantaran ke dalam bekas pengumpulan, dan letakkan bekas pengumpulan pada baki untuk membersihkan.

Buka injap balik, mulakan pam masuk, buka injap melalui, laraskan kelajuan pam dan TMP ke nilai yang sesuai. Buka pam pengisian semula, pastikan isipadu cecair dalam tangki pengambilan tidak berubah, dan mulakan dialisis isipadu yang sama. Mulakan masa apabila cecair memasuki bekas, dan rekod tekanan pada hujung masuk, hujung kembali dan jisim cecair pada selang masa yang sesuai, dan dapatkan kadar aliran serta-merta dengan pengiraan.

 

2.2.8 CIP

Mula-mula bilas dengan penimbal, kemudian bilas dengan air untuk suntikan (operasi 2.2.3), kemudian bersihkan dengan agen pembersih (operasi 2.2.4), dan akhirnya bilas dengan air untuk suntikan (operasi 2.2.3).

 

2.2.9 Ujian fluks air

Operasi adalah seperti berikut: 2.4.5.

 

2.2.10 Pemeliharaan kaset membran

Penyimpanan jangka pendek (Kurang daripada atau sama dengan 3 hari), simpan kaset membran dalam lekapan dan gunakan penyelesaian penyimpanan untuk berkitar selama 10 minit hingga 15 minit, tutup injap sistem, potong bekalan kuasa ke pam cecair, dan pastikan bahawa tangki salur masuk cecair dimeterai dengan betul.

Jika masa penyimpanan adalah 3 hari hingga 1 bulan, sila keluarkan kaset membran daripada lekapan dan tutupkannya ke dalam beg plastik atau bekas kedap udara lain. Tambah kira-kira 50mL hingga 100mL larutan penyimpanan ke dalam beg plastik atau bekas kedap udara dan tutupkannya. Atau ia boleh direndam terus dalam larutan penyimpanan. Jadual berikut mengesyorkan keadaan penyimpanan.

 

3 Keputusan dan analisis

 

3.1 Penyiasatan faktor-faktor yang mempengaruhi kecekapan penyingkiran pirogen

Tekanan operasi ultraturasan: 15 kelompok ujian dijalankan secara berterusan. Dalam setiap kelompok, tekanan penapisan dikekalkan pada 5, 10, 15 dan 2{{10}}psi semasa ultrafiltrasi, dan cecair penuaian virus dipekatkan 30 kali dan dicairkan dengan cecair penimbal (10 kali ganda isipadu) dalam aliran berterusan. Keputusan seperti yang ditunjukkan dalam jadual di bawah, kadar penyingkiran endotoksin adalah kurang daripada 87.0%, kadar pemulihan antigen adalah stabil pada 86.0%, dan kadar penyingkiran protein perumah adalah stabil pada 90.0%, menunjukkan bahawa tekanan operasi yang berbeza mempunyai sedikit pengaruh ke atas kesan pemulihan antigen, penyingkiran endotoksin dan penyingkiran protein perumah.

Nisbah kepekatan ultrafiltrasi: 15 kelompok ujian dijalankan secara berterusan. Dalam setiap kelompok, cecair penuaian virus telah tertumpu 30 kali, 50 kali, 80 kali dan 100 kali masing-masing semasa ultraturasan. Tekanan penapisan dikekalkan pada 20psi, dan cecair penampan (10 kali ganda isipadu) dicairkan dalam aliran berterusan. Keputusan seperti yang ditunjukkan dalam jadual berikut, kadar penyingkiran endotoksin adalah antara 53.3% hingga 86.9%, kadar pemulihan antigen kekal stabil pada 86.0%, dan kadar penyingkiran protein perumah adalah stabil pada 91.0%. Dalam pensampelan bersegmen, tiada antigen dikesan dalam larutan penghantaran, dan kurang daripada 10% daripada protein perumah kekal dalam larutan virus pekat. Kepekatan endotoksin dalam larutan pekat virus meningkat dengan peningkatan masa kepekatan, dan kadar penyingkiran endotoksin adalah yang tertinggi dalam sampel pekat sebanyak 80 kali, dan pengilang juga boleh mempertimbangkan kepekatan 100 kali, yang bukan sahaja meningkatkan kecekapan pengeluaran dan mengurangkan kos, tetapi juga memenuhi keperluan pengeluaran vaksin.

 

3.2 Kehabisan fluks kaset membran dan penjanaan semula pembersihan

Selepas rawatan, kadar pemulihan fluks membran ialah 92.6%. Kadar pemulihan pertama kaset membran baru adalah normal, mengikut sifat pemerhatian semasa cecair suapan, ramalan seterusnya masa kedua dan NTH, kadar pemulihan fluks kaset membran akan hampir dengan data selepas rawatan ini, dan cenderung stabil. Dalam masa 2j penggunaan sekali, pengurangan kaset membran adalah ideal, dan hanya 10% daripada fluks membran telah habis di bawah operasi keseluruhan.

3.2.1 Penipisan fluks dalam proses rawatan kaset membran

3.2.2 Hasil pembersihan dan penjanaan semula kaset membran

 

Mengenai Guidling

 

Guidling Technology ialah perusahaan teknologi tinggi negara yang memfokuskan pada biofarmaseutikal, kultur sel, penulenan dan kepekatan bioperubatan, diagnosis dan cecair industri. Kami telah berjaya membangunkan peranti penapis emparan, kaset ultraturasan & penapisan mikro, penapis virus, sistem TFF, penapis kedalaman, gentian berongga, dll. Yang memenuhi sepenuhnya senario aplikasi biofarmaseutikal, kultur sel, dan sebagainya. Membran dan penapis membran kami digunakan secara meluas dalam kepekatan, pengekstrakan dan pengasingan pra-penapisan, penapisan mikro, ultraturasan dan penapisan nano. Barisan produk kami yang banyak, daripada penapisan makmal sekali guna kecil kepada sistem penapisan pengeluaran, ujian kemandulan, penapaian, kultur sel dan banyak lagi, memenuhi keperluan ujian dan pengeluaran. Teknologi Guidling tidak sabar-sabar untuk bekerjasama dengan anda!